李以軍，張文濤，鄭作文△

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院藥劑科，南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室，南寧 530200)

壯藥依肝達(dá)是由飯湯子、田基黃、三姐妹3味藥組成，其中飯湯子具有清熱利濕、活血止血的功效；田基黃有散瘀止痛、清熱利濕、消腫解毒的功效；三姐妹具有發(fā)散風(fēng)寒、解毒、消腫止痛的功效。三味藥在廣西地區(qū)廣泛用于治療急慢性肝炎[1-3]。依肝達(dá)以飯湯子為公藥，田基黃與三姐妹為母藥組成復(fù)方中藥，用于乙型肝炎治療，課題組前期研究已證實其不僅能抗乙型肝炎病毒[4-6]，而且有保肝降酶的作用[7]，故本實驗以免疫抑制小鼠為模型，觀察依肝達(dá)對免疫抑制小鼠免疫功能的影響，以闡明依肝達(dá)是通過直接抑制病毒、保肝護(hù)肝及增強(qiáng)免疫功能三個方面協(xié)同起到治療乙型肝炎的，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供藥理學(xué)基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1動物、試劑及儀器 無特定病原體(SPF)級昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄兼用，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2009-0002)，適應(yīng)喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行實驗。環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號H32020857)；刀豆蛋白(ConA，美國Sigma公司，批號C8110)；印度墨水(北京市西中化工廠，批號060524)；鹽酸左旋咪唑片(桂林南藥股份有限公司，批號120202)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司,批號1243097)；2,4-二硝基氯苯(DNCB,成都西亞化工股份有限公司，批號201002161)；紫外分光光度計(美國PeiRinElmer公司)；電子天平(德國Sartorius公司，型號BP211D)；酶標(biāo)儀(奧地利Sunrise公司)；高速低溫離心機(jī)(德國Biofuge Stoctos 公司)。

1.2方法

1.2.1藥物的制備 依肝達(dá)浸膏：由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室制備。制備方法：取三姐妹200 g、飯湯子300 g、田基黃150 g，混勻后用10倍體積量95%乙醇浸泡2 h后水浴回流提取1.5 h，趁熱過濾，藥渣繼續(xù)用8倍體積量95%乙醇水浴回流提取1.0 h，趁熱過濾，再合并兩次濾液濃縮得40.4 g黑棕色浸膏，1.0 g浸膏相當(dāng)于13.6 g生藥量。依肝達(dá)高劑量：取10.0 g浸膏(相當(dāng)于136.0 g生藥量)用純凈水溶解稀釋定容至160 mL，得0.85 g生藥/mL；依肝達(dá)中劑量：取高劑量依肝達(dá)加純凈水稀釋1倍；依肝達(dá)低劑量：取中劑量依肝達(dá)加純凈水稀釋1倍。

1.2.2依肝達(dá)對免疫抑制小鼠血清溶血素(IgM)水平的影響 將SPF級昆明小鼠按體質(zhì)量分為空白組(生理鹽水)，模型組(生理鹽水)，陽性組(左旋咪唑0.5 g/kg)，依肝達(dá)高、中、低劑量組(依肝達(dá)劑量分別為17.00、8.50、4.25 g生藥/kg)，每組12只小鼠。各組灌胃給藥，1次/d，連續(xù)10 d，給藥體積均為20 mL/kg。除空白組外，其余各組小鼠從給藥第1天起，每2天背部皮下注射環(huán)磷酰胺溶液，劑量0.4 g/kg。在第5天，每只小鼠腹腔注射5%(v/v)的雞紅細(xì)胞懸液0.2 mL。小鼠末次給藥1 h后，拔眼球取血，離心制備血清，參照血清IgM的檢測方法[8]，先用生理鹽水將血清稀釋500倍后取0.5 mL加入試管中(空白對照用生理鹽水代替血清)，再依次加入0.5 mL的5%雞紅細(xì)胞懸液、10%補(bǔ)體(采集3只豚鼠血，混合分離血清，用生理鹽水稀釋成10%濃度)、生理鹽水，充分混勻后，37 ℃孵育1 h，3 000 r/min離心5 min，取上清液測量其540 nm處光密度值(OD)值，按下面公式計算IgM水平以HCIgM表示。HCIgM=標(biāo)本血清的OD值×稀釋倍數(shù)。

1.2.3依肝達(dá)對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 末次給藥1 h后，參照巨噬細(xì)胞吞噬功能測定方法[9]，各組小鼠尾靜脈注射10%印度墨水(0.1 mL/10 g)。分別于注射后2 min(t1)、10 min(t2)用毛細(xì)管從眼眶取血0.02 mL，加入含2 mL 0.1% Na2CO3溶液的試管中混勻，在波長600 nm下測OD值(得OD1、OD2值)。然后取出肝和脾稱質(zhì)量，按下面公式計算吞噬指數(shù)K值和吞噬系數(shù)α值。 K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)，α=1/3×K×體質(zhì)量/(肝質(zhì)量+脾質(zhì)量)。

1.2.4依肝達(dá)對免疫抑制小鼠補(bǔ)體C3、C4水平的影響 末次給藥1 h后小鼠眼球取血，低溫分離血清，當(dāng)日送往廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢測補(bǔ)體C3、C4水平。

1.2.5依肝達(dá)對免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響 各小鼠第1天給藥后均腹部脫毛，并在脫毛部位均勻涂上1% DNCB 丙酮溶液致敏。末次給藥1 h后，在各小鼠右耳均勻涂抹1% DNCB 丙酮溶液，24 h后處死小鼠，剪下左、右耳殼，用8 mm打孔器在雙耳同一部位打下耳片并稱質(zhì)量，計算左、右耳片質(zhì)量差值。

1.2.6依肝達(dá)對免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響 于末次給藥后第2天處死小鼠，參照脾淋巴細(xì)胞增殖實驗方法[10]，無菌環(huán)境中取脾，用無菌D-Hanks 液沖洗后，200目不銹鋼細(xì)胞篩過濾，細(xì)胞液1 000 r/min離心，棄上清液，加入紅細(xì)胞裂解液，吹打混勻后離心，棄上清液，用D-Hanks 液洗滌2次后轉(zhuǎn)移至含10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，培養(yǎng)液中懸浮著脾淋巴細(xì)胞，小鼠脾巨噬細(xì)胞貼壁生長，分離脾淋巴細(xì)胞后，將細(xì)胞濃度調(diào)成1×107/mL，加入96 孔板，每孔100 μL，再加入含有ConA的培養(yǎng)液100 μL，使ConA終濃度為10 μg/mL。置培養(yǎng)箱培養(yǎng)44 h，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測，用酶標(biāo)儀在波長570 nm 處測OD值。

2 結(jié) 果

2.1依肝達(dá)對免疫抑制小鼠血清IgM水平的影響 模型組小鼠的血清IgM水平低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，陽性組，依肝達(dá)高、中、低劑量組IgM水平均有顯著提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 依肝達(dá)對小鼠IgM水平的影響

a：P<0.01，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較；-：無數(shù)據(jù)

2.2依肝達(dá)對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 模型組小鼠吞噬指數(shù)K與吞噬系數(shù)α較空白組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，說明免疫抑制小鼠模型制備成功。與模型組比較陽性組小鼠的吞噬指數(shù)K與吞噬系數(shù)α升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，高劑量依肝達(dá)組小鼠吞噬指數(shù)K與吞噬系數(shù)α也升高，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 依肝達(dá)對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

a：P<0.05，b：P<0.01，與空白組比較；c：P<0.05，與模型組比較；-：無數(shù)據(jù)

2.3依肝達(dá)對免疫抑制小鼠血清補(bǔ)體C3、C4水平的影響 模型組小鼠血清補(bǔ)體C3、C4水平與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明免疫抑制小鼠模型制備成功。與模型組比較，陽性組小鼠血清補(bǔ)體C3、C4水平均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；依肝達(dá)高、中、低劑量組C3水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但對C4水平并無影響，見表3。

表3 依肝達(dá)對補(bǔ)體C3、C4水平的影響

a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.05，c：P<0.01，與模型組比較；-：無數(shù)據(jù)

2.4依肝達(dá)對免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響 模型組小鼠左、右耳質(zhì)量差值與空白組比較明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示遲發(fā)超敏反應(yīng)降低，免疫抑制小鼠模型制備成功。與模型組比較，陽性組小鼠左、右耳質(zhì)量差值顯著增高，依肝達(dá)高劑量組左、右耳質(zhì)量差值顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

2.5依肝達(dá)對免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響 模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力較空白組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明免疫抑制小鼠模型制備成功。陽性組與依肝達(dá)高、中、低劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力較模型組均顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表5。

表4 依肝達(dá)對小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響

a：P<0.01，與空白組比較；b：P<0.05，與模型組比較；-：無數(shù)據(jù)

表5 依肝達(dá)對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

a：P<0.01，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較；-：無數(shù)據(jù)

3 討 論

機(jī)體免疫功能低下是乙型肝炎患者的表現(xiàn)之一[11]，主要原因是體內(nèi)免疫功能長期處于耐受狀態(tài)，不能清除病毒而導(dǎo)致，針對乙型肝炎的治療，需從抑制病毒、保肝護(hù)肝和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能3個環(huán)節(jié)同時入手。壯藥依肝達(dá)作為復(fù)方中藥，能起到“多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、綜合調(diào)節(jié)”的臨床作用，前期研究已發(fā)現(xiàn)其能抑制乙型肝炎病毒復(fù)制及保肝降酶，故本研究著重探討其對機(jī)體免疫功能的作用。

機(jī)體免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞及免疫活性因子構(gòu)成。免疫器官包括骨髓、胸腺、肝臟、淋巴結(jié)、脾和黏膜等，免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，免疫活性因子包括抗體、溶菌酶、補(bǔ)體、免疫球蛋白、細(xì)胞因子等，當(dāng)機(jī)體受到外來毒素侵襲時，3個部分的免疫物質(zhì)會通過協(xié)同作用發(fā)揮機(jī)體防疫功能。

單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在機(jī)體免疫系統(tǒng)中占有很重要的作用，擔(dān)負(fù)著機(jī)體非特異性的防御功能，其組成有單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，其主要功能是吞噬和殺滅病原菌、對細(xì)菌毒素進(jìn)行滅活、抗原遞呈作用及釋放干擾素和白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫[12]，因此，巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)K和吞噬系數(shù)α是反映機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量依肝達(dá)(17 g/kg)能提高吞噬指數(shù)K及吞噬系數(shù)α，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示依肝達(dá)能提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

免疫球蛋白包括IgG、IgA、IgD、IgE、IgM，主要存在于血液及組織液當(dāng)中。當(dāng)機(jī)體被病原微生物等抗原刺激后，免疫球蛋白會與抗原生成抗原-抗體復(fù)合物，能有效阻斷病原體的致病作用[13]。其中IgM是機(jī)體體液免疫應(yīng)答中最早合成和分泌的抗體，在機(jī)體特異性免疫中起到重要作用，它的變化能及時體現(xiàn)B細(xì)胞活性狀況，是反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)之一[14]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，依肝達(dá)高、中、低劑量組均能提高免疫抑制小鼠IgM水平，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果提示依肝達(dá)能增加免疫球蛋白IgM水平。

補(bǔ)體系統(tǒng)是體內(nèi)非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，C3是補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑、替代激活途徑和凝集素激活途徑都必要的樞紐成分，在血清中諸補(bǔ)體成分中水平最高[15]。C4在血清中諸補(bǔ)體成分中水平僅次于C3，是參與補(bǔ)體傳統(tǒng)途徑活化的成分，合成于肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。C4在激活補(bǔ)體，促進(jìn)吞噬，防止免疫復(fù)合物沉淀和中和病毒等方面發(fā)揮作用。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)依肝達(dá)高、中、低劑量組均能提高免疫抑制小鼠補(bǔ)體C3水平，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但對C4水平無影響。

遲發(fā)型超敏反應(yīng)是抗原誘導(dǎo)引起的細(xì)胞性免疫應(yīng)答，當(dāng)效應(yīng)T細(xì)胞與特異性抗原結(jié)合反應(yīng)，引起的以單核細(xì)胞浸潤和組織損傷為主要特征的炎性反應(yīng)。此超敏反應(yīng)發(fā)生與抗體和補(bǔ)體無關(guān)，而與效應(yīng)T細(xì)胞和吞噬細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子或細(xì)胞毒性介質(zhì)有關(guān)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，依肝達(dá)高劑量組能提高免疫抑制小鼠左、右耳質(zhì)量差值，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示依肝達(dá)能增強(qiáng)免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)。

脾淋巴細(xì)胞是體內(nèi)免疫活性細(xì)胞，其增殖和分化能力是評價機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)之一。脾臟中T淋巴細(xì)胞是重要的免疫活性細(xì)胞，它能被有絲分裂原ConA所激活并向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化過程中 DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成增加，使細(xì)胞分裂增殖，測定體外脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能是研究細(xì)胞免疫功能的重要手段[16]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，依肝達(dá)高、中、低的劑量組均能促進(jìn)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

綜上所述，壯藥依肝達(dá)能提高免疫抑制小鼠的免疫功能，其作用主要包括提高IgM水平，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高補(bǔ)體C3水平，增強(qiáng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)及脾淋巴細(xì)胞增殖活性。