鄧世杰，馬辰宇，嚴(yán)巖，葉曉楓，王國祥,2,*

1. 南京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210023 2. 江蘇省地理信息資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省環(huán)境演變與生態(tài)建設(shè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省水土環(huán)境生態(tài)修復(fù)工程實(shí)驗(yàn)室，南京 210023

抗生素是一類天然、半合成或合成的化合物，主要用于殺死或抑制人或動物體內(nèi)的微生物[1]。自1928年問世以來，抗生素的研制技術(shù)不斷發(fā)展，目前發(fā)現(xiàn)的抗生素已經(jīng)達(dá)到數(shù)千種[2]。除在醫(yī)藥業(yè)作為藥物治療人類和動物疾病外，抗生素在農(nóng)業(yè)上亦有廣泛應(yīng)用，它可以作為肥料或畜禽飼料，提高動物、農(nóng)作物的質(zhì)量和產(chǎn)量[3]?？股丶捌浯x產(chǎn)物隨畜禽排泄物進(jìn)入環(huán)境介質(zhì)后，不易降解，能長時(shí)殘留，造成環(huán)境污染，危害人體健康，影響生態(tài)平衡[4]。我國是抗生素生產(chǎn)和使用大國，每年生產(chǎn)的抗生素超過200 000 t，國內(nèi)消耗的約占75%[5]。其中四環(huán)素類、喹諾酮類和磺胺類抗生素的使用量較大，但利用率不高，大部分以原藥的形式通過不同的途徑進(jìn)入環(huán)境，對環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染。并且，抗生素會在生物體內(nèi)富集，通過生物放大，對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)造成潛在的危害[6]。

抗生素對植物的生態(tài)毒性效應(yīng)研究多集中于對植株的影響[7]。黑麥草(Loliumperenne)是一種一年生或多年生植物[8]，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生物量大和根系發(fā)達(dá)等特點(diǎn)[9-11]，被廣泛用于草坪草種植，兼有降解污染物的功效[12]。黑麥草對鎘和鉛等土壤重金屬有較強(qiáng)的富集作用[13]。在人工濕地研究上，它對污水中的總氮和總磷有很好的去除效果[14]。目前，抗生素對黑麥草的生態(tài)毒性效應(yīng)研究主要是針對黑麥草植株，但抗生素對黑麥草種子的生態(tài)毒性效應(yīng)尚未明確。而種子萌發(fā)是黑麥草生命周期的起始階段，是黑麥草植株生長發(fā)育的先決條件，對黑麥草植株生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[15]。因此，有必要研究抗生素對黑麥草種子萌發(fā)的生態(tài)毒性效應(yīng)。

本試驗(yàn)以黑麥草種子為研究對象，研究四環(huán)素、環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶3種抗生素在不同濃度處理水平下對黑麥草種子發(fā)芽、根長和芽長的影響，并探討了抗生素脅迫對黑麥草種子根、芽伸長抑制率的影響，以期為評價(jià)抗生素污染的生態(tài)影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)選擇發(fā)育正常的意大利黑麥草種子，供試所用黑麥草種子由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。實(shí)驗(yàn)使用的試劑為3類抗生素，分別為四環(huán)素(純度98%)、環(huán)丙沙星(純度98%)、磺胺嘧啶(純度98%)，均購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

種子經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的H2SO4處理除去穎殼，用體積分?jǐn)?shù)為10%的H2O2溶液消毒10 min，之后用去離子水沖洗3遍，濾干。在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中放入2張濾紙，用鑷子將20粒種子整齊地排列在培養(yǎng)皿中，加入10 mL抗生素溶液，濃度梯度設(shè)定為：0、0.1、0.5、1、5和10 mg·L-1，對照中加入等量的去離子水，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)時(shí)，將培養(yǎng)皿置于25 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)，光照時(shí)間16 h·d-1，光照強(qiáng)度3 000 lx。

1.3 分析方法

1.3.1 發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及根長、芽長抑制率的測定

實(shí)驗(yàn)期間每天測定種子的發(fā)芽率，直到種子的發(fā)芽率趨于穩(wěn)定時(shí)，結(jié)束培養(yǎng)并測定根長和芽長，以此計(jì)算根長和芽長的抑制率。其中在第3天測定的種子發(fā)芽率為黑麥草種子的發(fā)芽勢。

發(fā)芽勢(%)=第3天時(shí)供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%[16]

發(fā)芽率(%)=供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%[16]

發(fā)芽指數(shù)(GI)=Σ(時(shí)間t的發(fā)芽數(shù)/相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù))[16]

根長或芽長抑制率(%)=(對照組-處理組)/對照組×100%[16]

1.3.2 半數(shù)抑制濃度(IC50)的計(jì)算

建立種子的根長、芽長抑制率與對應(yīng)的抗生素濃度的線性回歸方程，當(dāng)根長、芽長抑制率為50%時(shí)，對應(yīng)的抗生素濃度即為該種抗生素對根長、芽長的IC50值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。本文中數(shù)據(jù)為3組平行試驗(yàn)的平均值，或平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 抗生素對黑麥草種子發(fā)芽率的影響

抗生素對黑麥草種子發(fā)芽率的影響如圖1所示。黑麥草種子在不同抗生素濃度處理下均在第3天發(fā)芽，表明抗生素不會引起黑麥草種子萌發(fā)期的變化，但對種子萌發(fā)的過程有一定影響。在黑麥草種子發(fā)芽初期，四環(huán)素對黑麥草種子發(fā)芽有促進(jìn)作用，而環(huán)丙沙星、磺胺嘧啶有一定抑制作用。萌發(fā)過程第7天時(shí)，抗生素濃度超過5 mg·L-1時(shí)，四環(huán)素對種子發(fā)芽表現(xiàn)為促進(jìn)作用，環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶對種子發(fā)芽表現(xiàn)為抑制作用?；前粪奏ぬ幚硐拢瑢φ战M的種子發(fā)芽率均高于其他處理水平，且與濃度10 mg·L-1處理組差異顯著(P<0.05)。第10天后，3種抗生素處理下黑麥草種子的發(fā)芽率均趨于穩(wěn)定，且1 mg·L-1處理下種子的發(fā)芽率最高，該濃度實(shí)驗(yàn)組的發(fā)芽率與各自對照組相比，差異不顯著(P>0.05)。四環(huán)素對種子發(fā)芽率的最大無作用濃度(NOEC)為5 mg·L-1，而環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶對種子發(fā)芽率的NOEC為1 mg·L-1。有研究表明，一定濃度范圍的抗生素脅迫會提高植物種子活力，這可能是植物種子抵抗逆境的應(yīng)激反應(yīng)[17]。黑麥草種子雖經(jīng)受抗生素對它的影響，但它可通過自身代謝反應(yīng)阻止、降低或者修復(fù)由逆境造成的傷害，使其仍保持正常的生理活動，從而發(fā)芽率不會受到較顯著的負(fù)面影響，有時(shí)還可能得到促進(jìn)[18]。而濃度過高時(shí)，植物種子的抗氧化酶系統(tǒng)受到破壞，有關(guān)酶活力降低[19]，從而抑制種子萌發(fā)。不同種類抗生素處理下，黑麥草種子萌發(fā)結(jié)果不同，主要因?yàn)?種抗生素理化性質(zhì)有差異，對黑麥草種子的作用機(jī)制不同[20]。張乙涵等[21]研究表明，種子的種皮可阻礙抗生素脅迫對種子發(fā)芽帶來的負(fù)面影響，而種皮對不同抗生素的阻礙作用不同。并且種皮的阻礙作用是有限的，不能完全阻礙抗生素對種子的毒性效應(yīng)[20]。本研究中，環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶濃度達(dá)到10 mg·L-1時(shí)，種子發(fā)芽率受到顯著抑制(P<0.05)，說明此時(shí)抗生素已經(jīng)對種子發(fā)芽產(chǎn)生了毒性效應(yīng)。

2.2 抗生素對黑麥草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的影響

從表1可知，四環(huán)素處理下的黑麥草種子的發(fā)芽勢均高于對照組；而環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶處理下，黑麥草種子發(fā)芽勢均低于對照組。隨著四環(huán)素濃度的增加，發(fā)芽勢呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。濃度為1 mg·L-1時(shí)，種子的發(fā)芽勢最高，為65%，比對照組高15% (P<0.05)。在環(huán)丙沙星處理下，黑麥草種子發(fā)芽勢與濃度呈負(fù)相關(guān)，且各濃度的實(shí)驗(yàn)組發(fā)芽勢均顯著低于對照組(P<0.05)。在磺胺嘧啶處理下，黑麥草種子發(fā)芽勢與其濃度呈負(fù)相關(guān)，對照組的發(fā)芽勢與0.1 mg·L-1組差異不顯著(P>0.05)，與其他各組差異顯著(P<0.05)。各四環(huán)素處理組的發(fā)芽指數(shù)均高于對照組，環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶處理下發(fā)芽指數(shù)均低于對照組。但磺胺嘧啶處理下，種子的發(fā)芽指數(shù)總體上高于環(huán)丙沙星處理下的發(fā)芽指數(shù)。四環(huán)素對種子發(fā)芽勢的影響表現(xiàn)為促進(jìn)作用，環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶則表現(xiàn)為抑制作用。這可能是由于黑麥草對3種抗生素的吸收和降解能力存在差異。裴孟等[22]研究表明，黑麥草對四環(huán)素類抗生素的降解能力強(qiáng)于對磺胺類抗生素的降解能力，這可能與磺胺嘧啶的化學(xué)性質(zhì)較四環(huán)素穩(wěn)定有關(guān)。同時(shí)，抗生素對黑麥草根系區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)形成有一定影響，這會減弱黑麥草與微生物之間的養(yǎng)分循環(huán)，抑制種子發(fā)芽[23]。陳偉立等[24]的研究表明，植物的根系構(gòu)型亦可影響植物的各項(xiàng)生態(tài)過程。本研究中，抗生素可通過對黑麥草根際處微生物的影響，間接調(diào)控黑麥草的根系構(gòu)型，從而對其吸收水分、利用養(yǎng)分等生理與生態(tài)過程產(chǎn)生影響。

表1 3種抗生素處理下黑麥草種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)Table 1 Germination potential and germination index of the seeds of Lolium perenne under three antibiotics stress

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note: compared with the control, *P<0.05.

圖1 3種抗生素對黑麥草種子發(fā)芽率的影響Fig. 1 Effects of three antibiotics on germination rate of Lolium perenne seeds

圖2 3種抗生素對黑麥草種子根長和芽長的影響注：圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。Fig. 2 Effects of three antibiotics on root and bud length of Lolium perenne seeds Note: different letters in the graph represent significant differences (P<0.05), and the same letter represents no significant difference (P>0.05).

2.3 抗生素對黑麥草種子根長和芽長的影響

如圖2(a)所示，3種抗生素對黑麥草種子根長均有抑制作用。同種抗生素處理下，種子根長隨著濃度增加，均表現(xiàn)為先增加后減小。各濃度的四環(huán)素、環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶處理下，種子根長均顯著低于對照組(P<0.05)。如圖2(b)所示，3種抗生素對種子芽長均有抑制作用。四環(huán)素作用下，隨著其濃度升高，芽長逐漸減小，各組種子的芽長均顯著低于對照組(P<0.05)。環(huán)丙沙星作用下，種子芽長隨著濃度增加，表現(xiàn)為先增加后減小，各組種子的芽長均顯著低于對照組(P<0.05)?；前粪奏ぷ饔孟拢N子芽長的變化趨勢與環(huán)丙沙星的類似。由于3種抗生素濃度在0.1 mg·L-1時(shí)，種子的根長和芽長即受到抑制，因此，3種抗生素對種子根長、芽長的NOEC均在0～0.1 mg·L-1之間。

相關(guān)分析表明，四環(huán)素、環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶對根長的IC50值分別為9.846、9.415和3.989 mg·L-1，R2值分別為0.869、0.806和0.969；而它們對芽長的IC50分別為27.506、24.686和21.767 mg·L-1，R2值分別為0.513、0.931、0.784。因此，3種抗生素對種子根長抑制率的相關(guān)程度高于芽長，對黑麥草種子根(芽)長的抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋夯前粪奏?環(huán)丙沙星>四環(huán)素。

與芽長相比，根長受外界環(huán)境的影響更顯著。由于黑麥草幼苗根部直接與抗生素溶液接觸，對其中污染物的響應(yīng)較為迅速，因此，根長對外界污染物較敏感[25]。鮑艷宇等[26]的研究表明，芽對外源污染物的敏感程度不如根。只有當(dāng)抗生素濃度在黑麥草種子體內(nèi)的積累超出其耐受范圍時(shí)，黑麥草種子芽長才會受到顯著抑制。本研究中，當(dāng)抗生素濃度超過0.5 mg·L-1時(shí)，3種抗生素中磺胺嘧啶對根長的抑制作用最顯著；四環(huán)素、環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶對種子根長的IC50也表明，磺胺嘧啶對種子根長的抑制作用最顯著。這與林琳等[27]、金彩霞等[28]的研究結(jié)果類似。這可能是由于磺胺嘧啶與四環(huán)素或環(huán)丙沙星相比，降解更為緩慢[29]，作用更持久，因而對黑麥草種子的生長影響更顯著。

綜上，本研究表明，3種抗生素對黑麥草種子的發(fā)芽期無影響，但對萌發(fā)過程有一定影響：3種抗生素在1 mg·L-1處理水平下均能促進(jìn)種子發(fā)芽；四環(huán)素對種子發(fā)芽率的NOEC為5 mg·L-1，而環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶對種子發(fā)芽率的NOEC為1 mg·L-1。3種抗生素濃度超過其對應(yīng)的NOEC時(shí)，對黑麥草種子發(fā)芽即產(chǎn)生抑制作用。一定程度上，四環(huán)素對種子發(fā)芽勢有促進(jìn)作用，而環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶對種子發(fā)芽勢有抑制作用。四環(huán)素處理下發(fā)芽指數(shù)均高于對照組，環(huán)丙沙星或磺胺嘧啶處理下發(fā)芽指數(shù)均顯著低于對照組。在本試驗(yàn)中，根長和芽長在3種抗生素作用下均受到抑制，NOEC均在0～0.1 mg·L-1之間。對3種抗生素的生態(tài)毒性敏感順序?yàn)椋焊L>芽長。黑麥草種子萌發(fā)受3種抗生素影響程度依次為磺胺嘧啶>環(huán)丙沙星>四環(huán)素。