李健，吳聲敢，趙慧宇，楊桂玲

農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(杭州) 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州 310021

咪鮮胺(prochloraz)是一種廣譜咪唑類殺菌劑，能夠防治子囊菌和半知菌在作物上引起的病害，對大田作物、水果、蔬菜、草皮及觀賞植物上的多種病害具有治療和鏟除作用[1]。1998年至2006年，全國20個省、市76家企業(yè)登記產(chǎn)品95個廠次[1]。2008年，我國咪鮮胺原藥產(chǎn)量達(dá)到6 000余t[2]。隨著其大量使用，在水稻[3]、黃瓜[4]等多種作物和土壤中被檢出。土壤中殘留的咪鮮胺可以隨著雨水淋溶作用等進(jìn)入地表水，可能會對水生生物的生長、發(fā)育以及群落穩(wěn)定等造成不利影響。

多菌靈(carbendazim)是美國杜邦公司開發(fā)的殺菌劑苯菌靈的中間產(chǎn)物。20世紀(jì)70年代中期，中國、德國先后實現(xiàn)多菌靈的工業(yè)化生產(chǎn)，到20世紀(jì)80年代，多菌靈已發(fā)展成為我國工業(yè)化產(chǎn)量最大的內(nèi)吸性殺菌劑品種之一[5]。統(tǒng)計至2016年12月底，我國29個省、區(qū)、市686家企業(yè)登記多菌靈農(nóng)藥產(chǎn)品929個(原藥20個，單劑253個，復(fù)配制劑656個)。從登記作物來看，多菌靈大多數(shù)登記在谷物、果蔬等30多種可食用作物上，少量登記在綠萍、觀賞類花卉、橡膠樹和棉花等非食用作物上。在美國、歐盟和澳大利亞等國家和組織，除了少量園林植物，多菌靈已退出在食用農(nóng)作物上的登記[5]。2003年，英國抽查的252份梨樣品中，發(fā)現(xiàn)12%的樣品含有多菌靈殘留[6]，在我國許多農(nóng)作物中也普遍檢測到多菌靈[7-8]。有研究表明，多菌靈在土壤中的半衰期為6～12個月[6]，土壤中殘留的多菌靈會隨著雨水淋溶作用進(jìn)入地表水，加上其光穩(wěn)定性強(qiáng)，可能會對水生生物造成潛在的威脅。

在實際生產(chǎn)中，咪鮮胺可與大多數(shù)殺菌劑混合或復(fù)配使用[9]，其中咪鮮胺和多菌靈復(fù)配使用較為普遍。李銳等[10]的研究表明25%咪鮮胺·多菌靈可濕性粉劑對芒果炭疽病防治效果優(yōu)于單獨(dú)使用咪鮮胺和多菌靈。王良吉[11]的研究表明105 g·hm-2的咪鮮胺·多菌靈復(fù)配對油菜菌核病有較好的防治效果。農(nóng)藥的混合使用或者濫用導(dǎo)致環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥多殘留現(xiàn)象普遍。我國有超過70%的河流和地下水檢測出含有5種以上的農(nóng)藥殘留[12]。本實驗室歷年檢測結(jié)果顯示，咪鮮胺和多菌靈在果蔬中檢出率較高，分別為21.41%和27.68%，且存在同時檢出的情況。

近年來，多個文獻(xiàn)報道了農(nóng)藥聯(lián)合暴露對水生生物的聯(lián)合毒性研究。Wu等[13]研究了三唑磷與吡蟲啉聯(lián)合暴露對斑馬魚的聯(lián)合毒性。Wang等[14]報道了嘧菌環(huán)胺和醚菌酯對斑馬魚的聯(lián)合毒性。目前，有關(guān)咪鮮胺和多菌靈聯(lián)合暴露對水生生物的危害報道較少。本文以斑馬魚為模式生物，運(yùn)用靜態(tài)法和實時熒光定量PCR方法，研究咪鮮胺和多菌靈，及其二元組合對斑馬魚胚胎的急性毒性和對斑馬魚幼魚甲狀腺軸相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期為全面評估農(nóng)藥復(fù)合污染風(fēng)險提供必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的監(jiān)測預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：5415R臺式離心機(jī)(Eppendorf公司，德國)；RXZ-280智能光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠，中國)；StepOnePlusTM Real-Time PCR儀(Applied Biosystems公司，美國)。

試劑：咪鮮胺(純度為97%，湖北正興源精細(xì)化工有限公司)；多菌靈(純度為99%，湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司)；TakaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取RNA試劑盒，購自大連Takara公司。

1.2 實驗材料

實驗魚：斑馬魚(Brachydaniorerio)，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)監(jiān)測中心提供。無明顯的疾病和肉眼可見的畸形。斑馬魚飼養(yǎng)于恒溫(27±1) ℃魚房，保持14 h∶10 h光/暗條件，每天喂養(yǎng)2次新鮮孵化的豐年蝦。

魚卵收集：實驗前一天晚上，將成熟的斑馬魚以雌雄比1∶2的比例，配對放入產(chǎn)卵缸，次日清晨，開燈給予光照刺激使其交配產(chǎn)卵。收集魚卵，用系統(tǒng)水清洗并在顯微鏡下觀察，選取正常發(fā)育的胚胎，用于后續(xù)的暴露實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 斑馬魚胚胎急性毒性試驗

急性毒性試驗參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)的方法[15]，以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板作為染毒容器，每孔放置1枚受精卵，每個濃度設(shè)置2個重復(fù)。根據(jù)預(yù)備實驗結(jié)果，設(shè)定咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎的毒性試驗濃度(見表1)。分別于24、48、72、96 h時間點(diǎn)觀察并記錄死亡數(shù)和孵化數(shù)，及時取出死亡個體。根據(jù)卵是否出現(xiàn)白色凝結(jié)、小魚有無心率、血液是否流動等條件判斷斑馬魚死亡情況。

1.3.2 斑馬魚胚胎聯(lián)合毒性試驗

咪鮮胺和多菌靈聯(lián)合毒性試驗濃度設(shè)置為：以咪鮮胺和多菌靈單劑對斑馬魚胚胎的96 h-LC50作為各自的毒性單位，采用毒性單位1∶1的比例設(shè)置6個濃度梯度(見表1)，并設(shè)置1個空白對照(CK)。

聯(lián)合毒性評價按Marking的水生毒理聯(lián)合效應(yīng)的相加指數(shù)法(Additional Index)進(jìn)行評定[16]。公式如下：

S=Am/A1+Bm/B1+…

式中，S為生物毒性相加作用之和；A1,B1分別為A,B等毒物的毒性LC50值；Am,Bm為混合物毒性中各毒物的毒性LC50值[16]。

當(dāng)S≤1時：AI=1/S-1.0；當(dāng)S>1時：AI=1.0-S。

用相加指數(shù)法(AI)評價農(nóng)藥的聯(lián)合效應(yīng)：AI>0時為協(xié)同作用，AI<0時為拮抗作用，AI=0時為相加作用。

1.3.3 斑馬魚胚胎基因表達(dá)試驗

根據(jù)咪鮮胺和多菌靈單劑的LC50，設(shè)置高、中和低3個濃度和1個空白對照(見表2)。每個濃度設(shè)置3個重復(fù)，每個濃度隨機(jī)挑選100枚正常發(fā)育的胚胎放入500 mL燒杯中。將實驗組和對照組放入(26±1) ℃培養(yǎng)箱中暴露96 h，光暗周期為14 h∶10 h，每24 h更換一次藥劑。暴露結(jié)束后，每個濃度隨機(jī)挑選15條斑馬魚幼魚用于基因測定。

表1 咪鮮胺和多菌靈急性毒性實驗濃度設(shè)置Table 1 The concentration of prochloraz and carbendazim in acute toxicity experiments

按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄；用Quawell超微量分光光度計測定RNA的濃度和純化質(zhì)量；按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書在冰上配制20 μL反應(yīng)體系；反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸20 s；所用基因引物序列參考常菊花[17]的報道(見表3)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 7.5軟件進(jìn)行整理和分析，以濃度的對數(shù)值作為自變量(x)，斑馬魚死亡率作為因變量(y)，建立“劑量-效應(yīng)”線性方程，計算LC50和95%置信區(qū)間。

采用2-△△Ct方法[18]計算各基因mRNA的相對表達(dá)量，并通過T-test檢驗試驗組和對照組的差異顯著性(P<0.05、P<0.01表示差異顯著)，并用Origin 8.0軟件完成制圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎急性毒性

咪鮮胺對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為8.41 mg·L-1，根據(jù)現(xiàn)行毒性標(biāo)準(zhǔn)[19]屬于中毒(1～10 mg·L-1)，線性方程為y=4.71x-4.35，95%置信區(qū)間為4.75～10.35 mg·L-1，咪鮮胺對斑馬魚胚胎的LC50值隨著暴露時間的增加而降低(見表4)。

多菌靈對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為0.81 mg·L-1，屬于高毒(0.1～1 mg·L-1)，線性方程為y=4.59x-0.41，95%置信區(qū)間為0.57～1 mg·L-1，多菌靈對斑馬魚胚胎的LC50值隨著暴露時間的增加而降低(見表4)。

表3 實時熒光定量PCR引物序列Table 3 Primers used for quantification of mRNA expression by real-time PCR

表4 咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎的急性毒性Table 4 Acute toxicity of prochloraz and carbendazim to zebrafish

2.2 咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎聯(lián)合急性毒性

咪鮮胺對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為5 mg·L-1，線性方程為y=2.9x-2.03，95%置信區(qū)間為1.46～30.27 mg·L-1；多菌靈對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為0.61 mg·L-1，線性方程為y=7.08x+1.52，95%置信區(qū)間為0.52～0.71 mg·L-1。相加指數(shù)法計算結(jié)果表明，在24～96 h內(nèi)，AI值均小于0，表現(xiàn)為拮抗作用(見表5)。

2.3 斑馬魚幼魚甲狀腺軸基因表達(dá)

本實驗選取了6種斑馬魚甲狀腺軸上關(guān)鍵基因，來探究不同濃度的咪鮮胺、多菌靈及其二元組合對斑馬魚甲狀腺軸基因表達(dá)的影響。6種基因分別為：促甲狀腺激素釋放激素(CRH)、促甲狀腺激素(TSH)、甲狀腺激素受體(TRα)、脫碘酶(D1、D2)基因和甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TTR)。

(1)咪鮮胺、多菌靈和二元組合與對照組的基因表達(dá)比較

咪鮮胺抑制斑馬魚幼魚體內(nèi)的CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達(dá)，對TTR基因的表達(dá)沒有顯著影響(圖1)。暴露于低濃度咪鮮胺，斑馬魚幼魚體內(nèi)的CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達(dá)量分別下調(diào)99%、98%、61%、99%和99%，影響最為顯著；暴露于中濃度咪鮮胺，CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達(dá)量分別下調(diào)82%、85%、50%、87%和80%；暴露于高濃度咪鮮胺，CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達(dá)量分別下調(diào)37%、9%、39%、99%和95%。隨著咪鮮胺暴露濃度的增加，斑馬魚體內(nèi)的CRH、TSH和TRα基因的表達(dá)逐漸上調(diào)。

多菌靈抑制斑馬魚幼魚體內(nèi)的CRH、TSH、D1和D2基因的表達(dá)，對TTR基因的表達(dá)沒有顯著影響，不同濃度的多菌靈對TRα基因表達(dá)的影響存在差異(圖1)。暴露于低濃度多菌靈，斑馬魚體內(nèi)的CRH、TSH、D1和D2基因的表達(dá)量分別下調(diào)89%、87%、93%和85%，TRα基因的表達(dá)量上調(diào)36%；暴露于中濃度多菌靈，CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達(dá)量分別下調(diào)96%、94%、64%、62%和97%；暴露于高濃度多菌靈，CRH、TSH、TRα和D1基因的表達(dá)量下調(diào)70%、62%、45%和91%。

二元組合抑制斑馬魚體內(nèi)的CRH、TSH、D1和D2基因的表達(dá)，對TTR基因的表達(dá)沒有顯著影響，且不同濃度的二元組合對TRα基因表達(dá)的影響存在差異(圖1)。暴露于低濃度二元組合，斑馬魚幼魚體內(nèi)的CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達(dá)量分別下調(diào)94%、85%、72%、90%和95%；暴露于中濃度二元組合，CRH、TSH、D1和D2基因的表達(dá)量分別下調(diào)99%、98%、99%和99%，TRα基因的表達(dá)量上調(diào)37%；暴露于高濃度二元組合，CRH和TRα基因的表達(dá)量分別下調(diào)28%和51%，其他基因沒有顯著變化。

表5 咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎聯(lián)合急性毒性Table 5 Combined acute toxicity of prochloraz and carbendazim to zebrafish

(2)二元組合與咪鮮胺、多菌靈的基因表達(dá)比較

二元組合對斑馬魚體內(nèi)的TRα、TSH、D1和D2基因表達(dá)量的影響存在明顯差異。由圖1可知，暴露于0.11 mg·L-1咪鮮胺或0.01 mg·L-1多菌靈，TRα基因的表達(dá)量分別下調(diào)50%或64%，暴露于二元組合(0.11 mg·L-1咪鮮胺+0.01 mg·L-1多菌靈)，TRα基因的表達(dá)量上調(diào)37%；暴露于0.44 mg·L-1咪鮮胺，TSH、D1和D2基因的表達(dá)量分別下調(diào)9%、99%和95%，暴露于0.04 mg·L-1多菌靈，TSH、D1和D2基因的表達(dá)量分別下調(diào)62%、91%和21%，暴露于二元組合(0.44 mg·L-1咪鮮胺+0.04 mg·L-1多菌靈)，TSH、D1和D2基因的表達(dá)量與對照組相比沒有顯著差異。

圖1 咪鮮胺、多菌靈和咪鮮胺+多菌靈聯(lián)合暴露對斑馬魚幼魚甲狀腺軸基因表達(dá)量的影響注：P表示咪鮮胺，C表示多菌靈，P+C表示咪鮮胺+多菌靈。CRH為促甲狀腺激素釋放激素基因， TSH為促甲狀腺激素基因，TRα為甲狀腺激素受體基因，D1、D2為脫碘酶基因，TTR為甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。Fig. 1 Effects of different concentrations of prochloraz, canbendazim and prochloraz+canbendazim on the thyroid axis gene expression of zebrafish larvae Note: P denotes prochloraz; C denotes carbendazim; P+C denotes prochloraz+canbendazim. CRH stands for hormone releasing hormone gene; TSH stands for thyroid-stimulating hormone gene; TRα stands for thyroid hormone receptor gene; D1, D2 stand for deiodinase gene; TTR stands for thyroid hormone transporter gene.

3 討論(Discussion)

3.1 咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎的單一和聯(lián)合毒性

咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值分別為8.41和0.81 mg·L-1，表現(xiàn)為中毒和高毒。這與咪鮮胺對斑馬魚胚胎96 h-LC50值為8.5 mg·L-1[20]，多菌靈對斑馬魚胚胎96 h-LC50值在0.85～1.6 mg·L-1范圍內(nèi)[21]的結(jié)果類似。有研究表明，咪鮮胺對斑馬魚幼魚的96 h-LC50值為1.45 mg·L-1[22]，對斑馬魚成魚96 h-LC50值為4.6 mg·L-1[20]；多菌靈對斑馬魚成魚96 h-LC50值為7.64 mg·L-1[23]，對日本青鳉幼魚、仔魚96 h-LC50值分別為20.54和12.47 mg·L-1[24]。由此可見，不同種類的農(nóng)藥對不同生物不同發(fā)育階段的毒性是不同的。在等濃度配比下，咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值分別為5和0.61 mg·L-1，聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)，其結(jié)果與楊桂玲等[25]以HepG2肝臟細(xì)胞為試驗材料所得的結(jié)果是一致的。

3.2 咪鮮胺影響斑馬魚幼魚甲狀腺軸基因的表達(dá)

在咪鮮胺對斑馬魚染毒試驗中，咪鮮胺對CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達(dá)具有不同程度的抑制作用，且低濃度(0.03 mg·L-1)暴露組的抑制效果更為顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，咪鮮胺對斑馬魚幼魚可能具有潛在的甲狀腺干擾效應(yīng)，這與Brande-Lavridsen等[26]得到的咪鮮胺影響蝌蚪甲狀腺形態(tài)學(xué)變化的結(jié)論類似。甲狀腺軸相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制可能會減弱甲狀腺激素的合成和分泌，從而抑制幼魚的發(fā)育。例如，CRH、TSH表達(dá)量下調(diào)可能會減弱下丘腦和垂體對甲狀腺組織的刺激作用，使甲狀腺激素的合成和分泌減少；D2基因是催化甲狀腺激素(T4)脫碘生成高活性三碘甲腺原氨酸(T3)的關(guān)鍵酶，將D2基因敲除后，斑馬魚的發(fā)育將嚴(yán)重滯后[27]；D1基因在促進(jìn)T3的生成過程中發(fā)揮著重要作用[28]，D1和D2表達(dá)量同時下調(diào)，則可能會使T3的合成受到嚴(yán)重抑制；TRα基因表達(dá)量的下調(diào)，會導(dǎo)致甲狀腺激素合成受到抑制[29]。本研究中CRH、TSH、TRα、D1和D2基因表達(dá)量的下調(diào)，可能是因為甲狀腺激素合成受到抑制，從而使得與受體的結(jié)合減弱。

3.3 多菌靈影響斑馬魚幼魚甲狀腺軸基因的表達(dá)

在多菌靈對斑馬魚的染毒試驗中，多菌靈抑制斑馬魚體內(nèi)CRH、TSH、D1和D2基因表達(dá)。結(jié)果表明，多菌靈對斑馬魚幼魚具有潛在的甲狀腺干擾效應(yīng)?？赡艿母蓴_機(jī)制為：多菌靈抑制斑馬魚體內(nèi)的甲狀腺激素的合成，從而使得與受體的結(jié)合減弱。Barlas等[30]的研究表明多菌靈導(dǎo)致大鼠體內(nèi)的T3激素含量升高，且對大鼠甲狀腺造成組織病理損傷。Gawande等[31]的研究表明多菌靈導(dǎo)致大鼠體內(nèi)甲狀腺和腎上腺腺體組織病理學(xué)損傷。

3.4 聯(lián)合暴露影響斑馬魚幼魚甲狀腺軸基因的表達(dá)

與對照組基因表達(dá)相比，二元組合抑制斑馬魚體內(nèi)的CRH、TSH、D1和D2基因的表達(dá)，對TTR基因的表達(dá)沒有顯著影響，且不同濃度的二元組合對TRα基因表達(dá)的影響存在差異；與咪鮮胺、多菌靈基因表達(dá)相比，二元組合(0.11 mg·L-1咪鮮胺+0.01 mg·L-1多菌靈)對斑馬魚體內(nèi)的TRα、TSH、D1和D2基因表達(dá)量的影響表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。結(jié)果表明，CRH、TSH、D1和D2基因是斑馬魚內(nèi)分泌干擾分子毒性的重要靶位點(diǎn)，且不同劑量組對斑馬魚幼魚甲狀腺干擾效應(yīng)存在差異。Wu等[13]研究發(fā)現(xiàn)三唑磷+吡蟲啉聯(lián)合暴露與單獨(dú)暴露相比，斑馬魚體內(nèi)TSH、D1和D2基因有顯著差異，且這些基因表達(dá)量的變化可為早期的分子預(yù)警。樓欽欽等[32]研究發(fā)現(xiàn)對于內(nèi)分泌干擾物而言，其暴露于低劑量時可引起非劑量-效應(yīng)關(guān)系。

綜上所述，咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎毒性表現(xiàn)為中毒和高毒，聯(lián)合暴露表現(xiàn)出拮抗效應(yīng)；咪鮮胺和多菌靈單劑對斑馬魚具有潛在的甲狀腺干擾效應(yīng)，二元組合對斑馬魚幼魚體內(nèi)的基因表達(dá)存在非劑量-效應(yīng)關(guān)系。因此，在農(nóng)藥的風(fēng)險評估工作中，應(yīng)充分考慮二者的聯(lián)合毒性效應(yīng)。在未來的農(nóng)藥登記管理以及農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)制定中，單個農(nóng)藥的評估應(yīng)逐步向多殘留聯(lián)合暴露評估轉(zhuǎn)變，同時聯(lián)合毒性評價的結(jié)果也將需要應(yīng)用到相關(guān)殘留限量的制定中。