孟志鵬，劉 靜，胡四平，童 飛，龔浩杰

(1.浙江省湖州市中心醫(yī)院麻醉科 313000；2.浙江省湖州市婦幼保健院麻醉科 313000)

膿毒癥可導(dǎo)致全身多器官損傷，而肺臟因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與功能，成為最早、最易受累且病情最重的器官之一[1]，常表現(xiàn)為高病死率的急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)等危重癥，炎性反應(yīng)失衡是ALI的根本原因之一，盡管學(xué)者們對ALI的防治及肺保護(hù)研究已取得巨大進(jìn)展，但其病死率仍高達(dá)30%～40%[2]，臨床亟須尋求膿毒癥肺損傷的預(yù)防方案和治療藥物。右美托咪定(DEX)是一種高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，研究證實(shí)DEX因具有抗氧化、抗炎等獨(dú)特作用能減輕大鼠急性肺損傷[3]，特別是在膿毒癥患者ALI呼吸機(jī)支持治療時(shí)能減輕呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷或腎缺血再灌注肺損傷[4-5]。近年來，隨著對祖國醫(yī)學(xué)的重視及對ALI/ARDS的不斷研究，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)我國自主研發(fā)的傳統(tǒng)醫(yī)藥鹽酸戊乙奎醚(PHC)因作用于支氣管平滑肌和肺組織M1、M3受體，使支氣管平滑肌痙攣得到解除，肺順應(yīng)性增加，肺通氣得到改善，同時(shí)PHC是一種高選擇性的新型抗膽堿藥物[6]，能夠穩(wěn)定各種細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)，降低毛細(xì)血管通透性，緩解急性微循環(huán)功能障礙，還能抑制呼吸道腺體分泌，降低分泌物對肺部的感染，從而減輕肺組織損傷[7]，也有研究表明PHC抑制Toll樣受體-4表達(dá)，抑制大量炎性因子在肺內(nèi)聚集和浸潤，減輕肺部炎性反應(yīng)，發(fā)揮一定的肺保護(hù)作用[8]。本研究通過比較PHC與右美托咪定對內(nèi)毒素脂多糖(LPS)致大鼠ALI的保護(hù)性作用，探討PHC臨床治療ALI的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性健康清潔級SD大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量250～300g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物使用許可證號：SYXK(浙)2014-0001]，分組分籠每籠3～4只，安靜環(huán)境、室溫22～24 ℃下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食、飲水，模擬晝夜交替12 h。

1.2方法

1.2.1模型制備與分組 術(shù)前大鼠自由飲水，禁食12 h。腹腔注射10%水合氯醛400 mg/kg麻醉后，仰臥位固定于操作臺(tái)上稱重，行右股靜脈、右頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺、置管。術(shù)中保留自主呼吸。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組，每組10只。(1)LPS模型組(LPS組)：右股靜脈注射LPS(Escherichia coli O111:B4，美國 Sigma公司)6 mg/kg；(2)DEX治療組(L+D組)：LPS作用30 min后2 min內(nèi)右股靜脈注射DEX 50 μg/kg(江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，批號：16060132)，隨后以5 μg·kg-1·h-1微泵泵入；(3)PHC治療組(L+P組)：LPS作用30 min后2 min內(nèi)右股靜脈注射PHC 1 mg/kg(成都力思特制藥股份有限公司，批號：H20080606)，隨后以1 μg·kg-1·h-1微泵泵入。(4)0.9%生理鹽水對照組(對照組)：經(jīng)右股靜脈給予等量0.9%生理鹽水。

1.2.2標(biāo)本采集與標(biāo)本檢測 注射0.9%生理鹽水或LPS 6 h后，右頸動(dòng)脈采血2 mL后放血處死，血標(biāo)本用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β及IL-6水平。取右肺上葉5 mm×5 mm組織，甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋，切片(厚度約5 μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下行肺組織病理學(xué)檢查，并從中性粒細(xì)胞浸潤、肺泡間隔增寬、肺泡腔內(nèi)出血、肺泡腔滲出4個(gè)方面按嚴(yán)重程度行彌漫性肺泡損傷標(biāo)準(zhǔn)(DAD)評分：正常為0分，輕度為1分，中度為2分，重度為3分[9]；取右肺中葉組織，濾紙吸盡表面水分及血液，稱濕重(W)，然后置80 ℃電熱干燥箱內(nèi)烘烤24 h左右，待質(zhì)量恒定后稱干重(D)，計(jì)算肺組織濕/干重(W/D)比值。分離氣管，夾閉右支氣管，分3次用4 ℃ 0.9%生理鹽水按20 mL/kg行左支氣管肺泡灌洗，并回收左支氣管肺泡灌洗液(BALF)，離心后用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定BALF的TNF-α、IL-6水平，用二喹啉甲酸(BCA)法測定BALF中總蛋白(TP)水平。

2 結(jié) 果

2.14組血清炎性因子水平比較 與對照組比較，LPS組、L+D組、L+P組炎性因子水平升高(P<0.05)；與LPS組比較，兩個(gè)治療組TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯下降(P<0.05)；L+P組與L+D組TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組血清炎性因子水平比較

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與LPS組比較

2.2光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變 光鏡下，對照組中性粒細(xì)胞聚集、浸潤少，肺組織結(jié)構(gòu)無明顯損傷(圖1A)；LPS組可見大量以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞聚集、浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，破壞嚴(yán)重，肺泡間隔水腫、增寬明顯，肺泡腔大量滲出且伴有明顯出血(圖1B)；L+D組、L+P組肺組織損傷程度較LPS組輕，病理學(xué)改變程度較LPS組輕，L+D組與L+P組比較無明顯差異(圖1C、D)。

2.34組肺組織DAD評分和W/D比值比較 與對照組比較，其余3組DAD評分及W/D比值均明顯升高(P<0.05)；與LPS組比較，兩個(gè)治療組DAD評分及W/D比值均明顯下降(P<0.05)；L+P組與L+D組DAD評分及W/D比值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

A：對照組；B：LPS組；C：L+D組；D：L+P組

圖1各組肺組織病理學(xué)改變(HE染色，×200)

表2 各組DAD評分和肺組織W/D比值比較

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與LPS組比較

2.44組BALF中TNF-α、IL-6和TP水平比較 與對照組比較，其余3組BALF中TNF-α、IL-6和TP水平明顯升高(P<0.05)；與LPS組比較，兩個(gè)治療組TNF-α、IL-6和TP水平均下降(P<0.05)；L+P組與L+D組BALF中TNF-α、IL-6和TP水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組BALF中TNF-α、IL-6和TP表達(dá)水平比較

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與LPS組比較

3 討 論

通過實(shí)驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)靜脈注射DEX、PHC對LPS導(dǎo)致的大鼠ALI有保護(hù)作用。DEX、PHC注射可以顯著降低大鼠血清中炎性因子水平、BALF中炎性因子及TP水平，減輕由于LPS導(dǎo)致的肺部水腫損傷。DEX、PHC 可以通過抗炎對LPS導(dǎo)致的ALI起到早期保護(hù)作用。膿毒癥是臨床工作中常見的一種急危重癥，常引起全身多器官損傷，其中肺損傷病情重，發(fā)生早，常表現(xiàn)為ALI或者ARDS，是導(dǎo)致患者病死率居高不下的主要原因[10]。革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分是LPS，是引起膿毒癥性ALI的重要物質(zhì)，LPS水平與膿毒癥性ALI密切相關(guān)，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇股靜脈注射6 mg/kg LPS制備大鼠ALI模型[11]。筆者發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)LPS處理后，HE染色和光鏡下顯示出顯著特征性肺組織病理學(xué)改變，包括大量中性粒細(xì)胞浸潤、肺泡壁變薄、肺泡腔內(nèi)液體滲出、出血，肺組織DAD評分升高、W/D比值顯著升高，BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量增多，TP水平明顯升高等特征，表明制備大鼠ALI模型成功。

ALI的發(fā)病機(jī)制為肺部炎性反應(yīng)，也是ALI的中心環(huán)節(jié)。肺組織內(nèi)的炎性因子、趨化因子被激活后產(chǎn)生級聯(lián)免疫反應(yīng)。研究表明TNF-α、IL-6和IL-1β是ALI早期炎性反應(yīng)中較早升高的炎性因子，也作為ALI時(shí)炎癥介質(zhì)的始動(dòng)因素誘發(fā)多種炎性因子的表達(dá)，并在ALI的進(jìn)展中起到了重要作用[12]。其中，TNF-α是應(yīng)激反應(yīng)中最早產(chǎn)生的促炎因子，在ALI發(fā)生、發(fā)展中起到核心作用[13]。IL-1β是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種多功能促炎因子，大量聚集、浸潤于ALI肺泡液中，誘導(dǎo)早期蛋白的合成，在ALI的發(fā)生、發(fā)展中起到促進(jìn)作用；IL-6是由單核巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子，與TNF-α協(xié)同作用于ALI的進(jìn)程中，可比較準(zhǔn)確地反映肺組織的炎性反應(yīng)強(qiáng)度，其表達(dá)水平與ALI嚴(yán)重程度密切相關(guān)。其表達(dá)與ALI輕重程度一致[14]。因此，抑制炎性反應(yīng)是減輕LPS致ALI的有效方法之一。

DEX是一種新型高選擇性α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，因具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠、不抑制呼吸等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床。張琳等[15]研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠經(jīng)DEX處理后炎性因子釋放被抑制，炎性反應(yīng)程度減輕，膿毒癥大鼠的死亡率大大降低。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)DEX可以增加抗炎因子的表達(dá)，抑制中性粒細(xì)胞的浸潤，對腦、心、肺、腎等重要臟器具有一定的保護(hù)作用，其中，DEX的肺保護(hù)作用逐漸得到臨床研究者的重視[16]。

肺部組織中富含大量的M1、M3膽堿能受體，而PHC是一種新型抗膽堿藥，選擇性作用于M1、M3受體，減少腺體分泌，降低氣道阻力，增加肺順應(yīng)性，解除支氣管平滑肌和肺毛細(xì)血管痙攣，減輕肺水腫，改善肺功能。此外，PHC還能穩(wěn)定細(xì)胞膜及溶酶體、線粒體等細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)，抑制 TNF-α、IL-6等促炎因子釋放，減輕炎性反應(yīng)[8]。

本實(shí)驗(yàn)中大鼠靜脈注射LPS后，血清和BALF中上述炎性因子水平均有不同程度升高，出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng)。說明LPS打破了大鼠體內(nèi)的促炎和抗炎動(dòng)態(tài)平衡，炎性因子過度表達(dá)并向失控方向發(fā)展。TNF-α、IL-6和IL-1β大量生成和釋放。給予DEX或PHC治療后，血清和BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β明顯降低，表明二者的干預(yù)可以抑制膿毒癥大鼠炎性因子的釋放，減輕炎性細(xì)胞的浸潤，緩解LPS導(dǎo)致的肺組織炎性反應(yīng)，且二者治療效果沒有明顯差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，大鼠經(jīng)LPS干擾后，光鏡下肺組織病理學(xué)改變提示肺組織出現(xiàn)不定程度的損傷，肺組織DAD評分、W/D比值及BALF中的TP均有升高，給予DEX或PHC干預(yù)后，光鏡下觀察病理切片結(jié)果提示肺損傷情況較LPS組有明顯好轉(zhuǎn)，肺組織DAD評分、W/D比值及BALF中TP水平出現(xiàn)下降，表明肺泡水腫程度經(jīng)DEX或PHC治療后得到明顯改善，二者對LPS致ALI具有一定的保護(hù)作用，且二者療效無明顯差異。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明了DEX和PHC均可通過抗炎作用從而有效減輕肺組織的級聯(lián)炎性反應(yīng)及肺泡水腫程度，對LPS致大鼠早期ALI有一定的保護(hù)作用。但是本研究發(fā)現(xiàn)二者在明顯抑制炎性因子表達(dá)的情況下，ALI只是減輕，未全部緩解，推測ALI仍存在DEX和PHC作用以外的分子機(jī)制。其他可能的分子機(jī)制及二者能否改善ALI大鼠的最終預(yù)后有待進(jìn)一步研究證實(shí)。