張鳳英，朱克永

(四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 都江堰 611830)

隨著全球經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，“民以食為天”的思想伴隨著中國(guó)社會(huì)的小康生活快速、穩(wěn)定地發(fā)展，調(diào)味品的種類、數(shù)量都在不斷增加，醬油也從單一的散裝醬油、袋裝醬油、瓶裝醬油，從包裝的改進(jìn)發(fā)展到生抽、老抽、低鹽醬油以及180 d發(fā)酵零添加醬油等，這都體現(xiàn)了我國(guó)人民群眾對(duì)食品安全與衛(wèi)生的要求進(jìn)一步提高。根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的食品微生物學(xué)檢驗(yàn)要求，對(duì)于大腸菌群如大腸桿菌[1]、埃希氏菌、沙門氏菌以及含有O157基因的菌都成為了必檢指標(biāo)[2]。食物中大腸菌落的數(shù)量和密度也成為校驗(yàn)產(chǎn)品是否合格的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)，李巖冰[3]通過(guò)對(duì)紹興地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品(醬油、腐乳以及黃酒等)按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求進(jìn)行微生物測(cè)定，結(jié)果表明：菌落總數(shù)、含O157:H7基因的大腸菌群超標(biāo)主要出現(xiàn)在發(fā)酵調(diào)味品中。品牌與標(biāo)準(zhǔn)化雜志公布的國(guó)家質(zhì)檢總局對(duì)豆類發(fā)酵制品(醬油、食醋、醬)的抽查結(jié)果發(fā)現(xiàn)了10種不合格產(chǎn)品，主要涉及的是菌落總數(shù)[4]，這說(shuō)明檢測(cè)發(fā)酵調(diào)味品中的有害菌是十分必要的。大腸菌落主要寄居在動(dòng)物、人類的糞便中，如果檢測(cè)結(jié)果超標(biāo)，則意味著食物受到污染，不符合人民群眾的日常生活需求，不能達(dá)到市場(chǎng)流通的標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)根據(jù)市場(chǎng)和人民群眾的基本要求，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.3-2016，即每1 g(或者每1 mL)產(chǎn)品中，檢驗(yàn)出的大腸桿菌數(shù)值(MPN)，需滿足不大于3 MPN的標(biāo)準(zhǔn)。但楊素霞[5]通過(guò)對(duì)全國(guó)部分地區(qū)市售的20份醬油樣品進(jìn)行微生物學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果表明樣品中存在的微生物主要是霉菌、酵母菌以及少量的有害芽孢桿菌，但是沒有檢測(cè)到大腸菌群。此結(jié)果對(duì)于檢測(cè)醬油中大腸菌群的可靠性和必要性都提出了質(zhì)疑和相反的結(jié)論。

基于此，本文根據(jù)相關(guān)檢測(cè)案例、結(jié)果結(jié)合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法探討檢測(cè)成品醬油中大腸菌群的研究方法、過(guò)程、結(jié)果、可靠性。

1 大腸菌群檢測(cè)案例與研究現(xiàn)狀

對(duì)成品醬油中的大腸桿菌檢測(cè)其實(shí)早已經(jīng)開始了。2013年《中國(guó)調(diào)味品》報(bào)道的案例[6]：早在1974年，安徽省蕪湖市的一個(gè)衛(wèi)生防疫站就為當(dāng)時(shí)收集到的100多份成品進(jìn)行致病衛(wèi)生的檢測(cè)，包括大腸菌群、其他雜菌和致病菌，結(jié)果表明全部樣品均檢測(cè)有大腸菌落。檢測(cè)完的醬油樣品在37 ℃的恒溫箱環(huán)境下存放2個(gè)晝夜以后，卻發(fā)現(xiàn)大腸菌落的數(shù)量已經(jīng)少到檢測(cè)不出[7]。在2012年以后，江蘇省淮陰縣的衛(wèi)生防疫站為了進(jìn)一步探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，也對(duì)部分醬油產(chǎn)品展開了檢測(cè)。與蕪湖市的衛(wèi)生院相比，此次的檢測(cè)更加具有規(guī)范性，相關(guān)檢驗(yàn)人員以含有不同氯化鈉濃度的醬油做比較，在相同的環(huán)境下，靜置這些醬油，并每隔5 h檢測(cè)醬油內(nèi)部的大腸菌落數(shù)量一次，因?yàn)榇伺e更具有可靠性。檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，大腸桿菌菌落的數(shù)量逐漸減少，且醬油中NaCl越高，大腸菌群減少得速度越快，但同之前的案例結(jié)果一致的是：48 h是分界線，超過(guò)保留時(shí)間以后，工作人員無(wú)法檢測(cè)出大腸菌落了。

我國(guó)食品類輕工業(yè)在改革開放初期發(fā)展緩慢，技術(shù)革新較慢，安全衛(wèi)生工作起步較晚，尚有眾多亟待解決的問題。國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 2717-2003對(duì)醬油產(chǎn)品的大腸菌落數(shù)量有明確的要求：菌落總數(shù)不超過(guò)30000 CFU/mL；大腸菌群不超過(guò)30 MPN/dL。史夢(mèng)雨[8]參照GB 14934-2016的規(guī)定，使用了液態(tài)產(chǎn)氣發(fā)酵培養(yǎng)法和紙片法測(cè)定消毒餐具中大腸菌群指標(biāo)，結(jié)果表明兩種不同方法檢測(cè)的合格率相差1.01%左右，說(shuō)明兩種方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性相當(dāng)，但由于紙片法能夠節(jié)省時(shí)間，可以用于大量樣品檢測(cè)大腸菌群。朱素芬[9]則對(duì)比了平板計(jì)數(shù)法與測(cè)試紙片法對(duì)食物中大腸菌群的敏感性、準(zhǔn)確率等，結(jié)果表明：測(cè)試紙片法檢出限更低，適合食品中大腸菌群污染的指示和分析。裴曉燕等[10]于2017年收集了全國(guó)31個(gè)省的預(yù)包裝醬油樣品，通過(guò)檢測(cè)其微生物污染情況，結(jié)果顯示個(gè)別醬油中耐鹽性菌超標(biāo)，但大腸菌群檢出率在所有醬油中占比不到1%。醬油釀造時(shí)間成熟后需要加熱殺菌和增加成品醬油的風(fēng)味和口感，檢出大腸桿菌很有可能是加熱溫度不夠或者加熱時(shí)間不足，但周家達(dá)認(rèn)為只要醬油中食鹽含量較高(目前一般醬油中食鹽含量沒有硬性規(guī)定，一般為不少于18 g/dL)，非耐鹽性大腸桿菌不能在醬油中長(zhǎng)期存活。

因企業(yè)必須在符合國(guó)家食品安全衛(wèi)生的規(guī)范下操作，這樣才能避免內(nèi)部人員和物力的浪費(fèi)，提升效率，最終實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益的進(jìn)步。因此本文在原有研究的基礎(chǔ)上完善相應(yīng)檢測(cè)，從耐鹽大腸菌落的角度出發(fā)，進(jìn)一步對(duì)大腸菌群展開必要的質(zhì)疑，提升國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的意義。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

根據(jù)目前國(guó)家現(xiàn)行的GB/T 4789.22-2003要求，菌落總數(shù)測(cè)定按照GB/T 4789.2-2016執(zhí)行，大腸菌群測(cè)定按照GB/T 4789.3-2016執(zhí)行。本文所使用的大腸埃希氏菌的編號(hào)是ATCC8739，試管斜面保存在溫度為4 ℃的冰箱中，確保大腸埃希氏菌能夠正常地生存和繁衍，滿足實(shí)驗(yàn)的基本要求，可以保證實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的可靠性和價(jià)值性，與人們?nèi)粘Ｉ盍?xí)慣和水平密切相關(guān)。檢測(cè)儀器的精密度高低，直接與檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度密切相關(guān)，因此為保證數(shù)據(jù)的可靠性，實(shí)驗(yàn)人員選擇壓力滅菌鍋來(lái)降低其他菌種的影響，選擇超凈工作臺(tái)降低檢測(cè)難度，提升檢測(cè)的效率，滿足實(shí)驗(yàn)的基本要求[11,12]。

由食品系生產(chǎn)的不含鹽的豆渣發(fā)酵液(醬油)，經(jīng)過(guò)121 ℃，20 min處理后進(jìn)行滅菌，分裝在250 mL三角瓶中，每瓶放125 mL。為保證大腸菌落生存的基本要求，培養(yǎng)基必不可少，綜合考慮培養(yǎng)基價(jià)格成本和耐久性，本實(shí)驗(yàn)選擇月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基，英文名縮寫為L(zhǎng)ST，符合大腸菌落的繁衍需求。除此之外，培養(yǎng)基還選擇煌綠乳糖膽鹽肉湯，英文名縮寫是BGLB，這兩種培養(yǎng)基混合使用，幾乎符合所有大腸桿菌的營(yíng)養(yǎng)要求，且不會(huì)因?yàn)樯娓?jìng)爭(zhēng)問題而出現(xiàn)菌落數(shù)自主降低的情況，排除無(wú)關(guān)變量的干擾，降低偶然性帶來(lái)的影響。醬油鹽分高低控制選擇的是最簡(jiǎn)單的氯化鈉，即NaCl，食用鹽的主要成分，安全可靠、操作簡(jiǎn)單且成本低廉。

2.1 材料和配方

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST，g/L)：胰蛋白胨20 g、氯化鈉5 g、乳糖5 g、磷酸氫二鉀2.75 g、磷酸二氫鉀2.75 g、月桂基硫酸鈉0.1 g，將所有試劑放入2 L燒杯中，在電爐上加熱攪拌溶解于1000 mL蒸餾水中,待全部溶解后分裝到有倒立發(fā)酵管的20 mm×150 mm試管中， 每管10 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。接入樣品后在(36±1) ℃水浴培養(yǎng)(48±2) h，觀察生長(zhǎng)以及產(chǎn)氣情況。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

制作含鹽較低的醬油原汁(將黃豆蒸煮后搗碎，接入米曲霉，加入鹽水18%左右，待發(fā)酵成熟，將醬油原汁滅菌后加入蒸餾水，稀釋到所需含鹽量比例的無(wú)菌醬油汁)接入大腸埃希氏菌，觀察液體培養(yǎng)基中的產(chǎn)氣情況，將微產(chǎn)氣和不產(chǎn)氣試管中菌液接入平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)，再通過(guò)革蘭氏染色法用高倍顯微鏡觀察和掃描電子顯微鏡(SEM)、熒光顯微鏡、假彩色透射電子顯微鏡觀察在低濃度食鹽和高濃度食鹽醬油中的形態(tài)，分別進(jìn)行定性和定量分析，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

3 實(shí)驗(yàn)的主要措施手段

要保證實(shí)驗(yàn)的正常開展，首先要確保大腸桿菌的基本生存情況，需要將早前存放在冰箱中的大腸桿菌及其菌落從冰箱中取出，接種到培養(yǎng)基以后，放在溫度37 ℃左右的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)一段時(shí)間進(jìn)行活化，因?yàn)檫@個(gè)溫度很接近人體溫度，在這種模擬人體環(huán)境的前提下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能更加具有現(xiàn)實(shí)意義。培養(yǎng)時(shí)間約48 h即可，大腸桿菌數(shù)量能保證在穩(wěn)定期，且菌體數(shù)穩(wěn)定。把大腸桿菌培養(yǎng)液均勻分在幾個(gè)試管中，再將這些培養(yǎng)液分別放置在濃度不同但溫度同為37 ℃的肉湯培養(yǎng)基中，反復(fù)培養(yǎng)以提升可靠性。最終選擇那些長(zhǎng)期數(shù)量穩(wěn)定的一批次作為最后的檢測(cè)。大腸桿菌培養(yǎng)完成以后，就能展開后續(xù)的生存檢測(cè)，只要將培養(yǎng)液接種到預(yù)先準(zhǔn)備的醬油中，控制醬油溶液中食鹽的濃度為2%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、22%，分別放置在室溫下即可，因?yàn)槿粘Ｊ褂冕u油時(shí)，都是在室溫環(huán)境中，而非37 ℃的恒溫環(huán)境中。檢測(cè)人員在一段時(shí)間以后，就能對(duì)靜置的醬油展開大腸桿菌濃度分析，取樣調(diào)查即可，檢測(cè)方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.3-2010相同，操作合理規(guī)范。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析和統(tǒng)計(jì)

將大腸埃希氏菌放入含有不同濃度食鹽的醬油中進(jìn)行培養(yǎng)，分別于24，48，72 h查看倒立管中是否有氣體存在，為驗(yàn)證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，在無(wú)氣體產(chǎn)生的醬油中挑取大腸埃希氏菌落在平板上過(guò)培養(yǎng)查看大腸菌群的菌落，大腸菌群多次誘導(dǎo)培養(yǎng)的結(jié)果見表1。

表1 耐鹽大腸菌落的培育數(shù)據(jù)Table 1 Cultivation data of salt-tolerant coliforms

由表1可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間不斷延長(zhǎng)，食鹽濃度不斷提升，大腸菌落的耐鹽性逐漸降低。

圖1 大腸埃希菌菌落特征Fig.1 Colony characteristics of Escherichia coli

醬油含鹽量為7%培育48 h溶液經(jīng)過(guò)稀釋后在平板上培養(yǎng)48 h后生長(zhǎng)的菌落圖見圖1，但是在10%濃度下培養(yǎng)48 h以上幾乎無(wú)菌落。

5% 和7%濃度醬油液體培養(yǎng)48 h后在高倍顯微鏡下觀察到的大腸埃希菌革蘭氏染色圖見圖2。

圖2 不同濃度醬油液體培養(yǎng)的革蘭氏染色顯微鏡觀察圖Fig.2 Gram staining microscopic observation by liquid culture of soy sauce with different concentration

由圖2可知，5%濃度培養(yǎng)液中菌體染色顏色較深，菌體粗大強(qiáng)壯，而7%濃度的培養(yǎng)液中染色很淺，菌體數(shù)明顯很少，活躍成功度較低。菌落的有無(wú)可以定性地看出菌落是否存活的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也在一定程度上表明，大腸埃希氏菌的耐鹽性不能在短時(shí)間內(nèi)獲得，菌體的繁殖與鹽分及培育時(shí)間密切相關(guān)，高濃度食鹽對(duì)大腸埃希氏菌具有抑制作用。醬油產(chǎn)品生產(chǎn)、罐裝、銷售以及保藏都是在室溫條件下，在室溫下的大腸菌接種大腸菌數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。

表2 4 h和12 h后的大腸菌落數(shù)Table 2 Colony number of coliforms after 4 h and 12 h

由表2可知，鹽分濃度超過(guò)19 g/dL時(shí)，即使大腸菌落具有較強(qiáng)的耐鹽性，也不能長(zhǎng)時(shí)間生存。且即使?jié)舛炔⑽闯^(guò)19 g/dL，時(shí)間達(dá)到24 h以后，菌落也無(wú)法生存。

圖3 不同濃度醬油液體培養(yǎng)的菌體假彩色透射電子顯微鏡觀察圖Fig.3 Pseudo-color transmission electron microscopic observation of bacteria by liquid cultured of soysauce with different concentration

不同濃度醬油的大腸埃希菌的假彩色透射電子顯微鏡觀察圖見圖3。

綠色的菌體是正常狀態(tài)下的菌體，細(xì)胞壁較厚，較為明顯的擬核，右圖是在18%濃度醬油中培養(yǎng)24 h的菌體圖，內(nèi)容物已經(jīng)外滲，擬核變大、瀕臨破碎，由圖3可知，大腸埃希氏菌對(duì)中低濃度的鹽溶液耐受性很差，這同前人對(duì)于大腸菌群耐鹽的研究結(jié)果一致。

圖4 不同濃度醬油液體培養(yǎng)的菌體電子顯微鏡(SEM)觀察圖Fig.4 SEM observation of bacteria by liquid cultured of soysauce with different concentration

而通過(guò)掃描隧道電子顯微鏡觀察到的正常培養(yǎng)條件下菌體長(zhǎng)度均一，飽滿，生物量大；圖4中右圖為10%濃度下培養(yǎng)24 h的醬油汁中單場(chǎng)菌群SEM圖，超過(guò)10%含鹽量的醬油汁中難以觀察到成型的大腸菌群形態(tài)。

日常的食用醬油，都是經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的釀造和暴曬工序，而且為了提高滋味、口感，食鹽的添加量不少于18 g/dL,大腸菌無(wú)法保證基本的存活要求。成熟醬油基本都能接近食鹽飽和的濃度，章志超[13]通過(guò)測(cè)定市售醬油中的不同指標(biāo)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在不同級(jí)別的醬油中失活速率不同，而且溫度也能影響其失活。黃文彪等[14]測(cè)定了同種大腸桿菌在老抽、生抽醬油中的存活時(shí)間，在老抽醬油中存活時(shí)間較長(zhǎng)，約為2～4 d。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出以下結(jié)論：大腸菌并沒有很強(qiáng)的耐鹽能力，所以醬油生產(chǎn)商只要確保必要的鹽分濃度，就能在很大程度上降低大腸菌落的負(fù)面影響，從根本上杜絕大腸菌的生存。不僅如此，即使大腸菌的生存條件已經(jīng)得知，醬油生產(chǎn)商依舊需要按照國(guó)家制定的基本標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)即將流通于市場(chǎng)的醬油展開抽查工作，確保其有關(guān)菌落濃度均在合理的范圍內(nèi)，對(duì)人體健康絕對(duì)無(wú)害，這樣才能適應(yīng)當(dāng)下可持續(xù)發(fā)展的基本目標(biāo)，落實(shí)以人為本的理念，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益與社會(huì)效益和諧統(tǒng)一的關(guān)系，也能夠確保企業(yè)在越發(fā)激烈的市場(chǎng)上有核心競(jìng)爭(zhēng)力。簡(jiǎn)言之，醬油生產(chǎn)必須符合國(guó)家有關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，將于2019年12月21日開始實(shí)施的新的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2717-2018、GB 8953-2018都已經(jīng)對(duì)正在實(shí)施的國(guó)標(biāo)進(jìn)行了調(diào)整，尤其根據(jù)很多研究者對(duì)醬油產(chǎn)品的研究成果對(duì)微生物尤其對(duì)現(xiàn)行的GB 2717-2003微生物指標(biāo)進(jìn)行了調(diào)整：菌落總數(shù)(CFU/mL)由原來(lái)的不超過(guò)30000變更為按照GB 4789.2-2016的方法檢測(cè)結(jié)果需要低于菌落總數(shù)(CFU/mL)n：5、c：2、m：5×103、M：5×104。對(duì)大腸菌群的檢測(cè)指標(biāo)變化最大由原來(lái)的30 MPN/dL變更為：參照GB 4789.3-2016平板計(jì)數(shù)法檢出的指標(biāo)需要符合大腸菌群(CFU/mL)n：5、c：2、m：10、M：102。但是醬油的基本質(zhì)量檢查工作必不可少，確保醬油不受霉菌、腐敗酵母的污染，才能讓合格產(chǎn)品流入市場(chǎng)，否則檢測(cè)工作就失去了它基本的意義和價(jià)值，而對(duì)于檢測(cè)大腸菌群根本沒有推崇的必要，值得引起有關(guān)人士的重視，并展開適度的完善工作。

5 結(jié)論

醬油產(chǎn)品檢測(cè)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，隨著時(shí)間的不斷推移而逐步完善，近幾年來(lái)更是取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)步，質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果和方法都進(jìn)一步完善，與人們生產(chǎn)生活的契合度提升效果明顯，穩(wěn)中有進(jìn)。所以醬油在生產(chǎn)過(guò)程中，一定要按照規(guī)范進(jìn)行，嚴(yán)格控制溫度，普通消費(fèi)者在食用的過(guò)程中，也要增強(qiáng)自己的信心，不用過(guò)分擔(dān)心大腸菌群?jiǎn)栴}。