于江，劉永軒，于貞*

(1.煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2.山東魯花生物科技有限公司，山東 萊陽(yáng) 265200)

醬油是起源于中國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，已經(jīng)有兩千多年歷史，由于其獨(dú)特的風(fēng)味以及豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，已成為世界人民飲食生活中不可或缺的調(diào)味品[1]。釀造醬油是以來(lái)自大豆和小麥的植物蛋白及碳水化合物為主要原料，經(jīng)過(guò)微生物酶或細(xì)胞作用釀造而成。發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)水解生成20多種氨基酸，且含有人體必需的8種氨基酸[2],以小分子的糖類、多種醇、有機(jī)酸等為基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)發(fā)酵過(guò)程中復(fù)雜的生物化學(xué)變化，形成具有特殊色澤、香氣、口感的調(diào)味品醬油[3,4]。醬油中的有機(jī)酸種類很多，比如草酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、甲酸、蘋果酸、檸檬酸，但含量很少，有機(jī)酸除了調(diào)節(jié)醬油的酸味之外，它們還是形成酯類必不可缺少的成分，由此可見，有機(jī)酸不但關(guān)系到醬油的風(fēng)味，而且是關(guān)系到醬油質(zhì)量?jī)?yōu)劣的關(guān)鍵因素[5，6]。

本文采用液相色譜法對(duì)醬油中的有機(jī)酸進(jìn)行了檢測(cè)，并跟蹤了醬油發(fā)酵過(guò)程中的有機(jī)酸含量，對(duì)成熟醬油進(jìn)行了感官品評(píng)，利用主成分分析法將有機(jī)酸含量與醬油品質(zhì)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以期找到對(duì)醬油品質(zhì)影響較大的有機(jī)酸。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

醬油：山東魯花生物科技有限公司。

草酸、乳酸、丁二酸、檸檬酸、丙酮酸、酒石酸、蘋果酸、甲酸和乙酸(均為AR)：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；硫酸(AR)：萊陽(yáng)開發(fā)區(qū)精細(xì)技術(shù)化工廠；娃哈哈飲用純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；0.45 μm膜：上海興亞凈化材料廠。

LC-210A HT高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

1.2.1.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液配制

精確稱取二水合草酸1.5417 g，丁二酸1.0379 g，蘋果酸1.0524 g，乳酸0.6071 g，一水合檸檬酸0.5174 g，酒石酸0.2478 g，丙酮酸0.1016 g，甲酸0.1304 g，乙酸0.3204 g；用純凈水溶解并定容至100 mL，得到草酸11.012 g/L，丁二酸10.379 g/L，蘋果酸10.524 g/L，乳酸6.071 g/L，檸檬酸4.7305 g/L，酒石酸2.478 g/L，丙酮酸1.016 g/L，甲酸1.304 g/L，乙酸3.204 g/L的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合酸原液。

以原液為1號(hào)，分別準(zhǔn)確移取原液7，4，1，0.8 mL到10 mL比色管內(nèi)定容，得到梯度系列的混合酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，記為2，3，4，5號(hào)。

1.2.1.2 醬油處理

醬油原液稀釋不同的倍數(shù)后，膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣。

1.2.2 色譜條件

采用Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)有機(jī)酸柱，流動(dòng)相為0.5 mmol/L H2SO4溶液，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為30 ℃。

1.2.3 發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量的測(cè)定

成曲入罐發(fā)酵后，每個(gè)月取樣壓榨一次，測(cè)定醬油發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量的變化。

1.2.4 成熟醬油的感官品評(píng)

醬油發(fā)酵成熟后進(jìn)行壓榨，經(jīng)專家進(jìn)行感官品評(píng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液色譜圖

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液色譜圖見圖1。

圖1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard mixed solutionof organic acids

注：圖1中1～9號(hào)峰分別為：草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、丙酮酸、丁二酸、乳酸、甲酸、乙酸。

2.2 醬油中各有機(jī)酸色譜圖

醬油中各有機(jī)酸色譜圖見圖2。

圖2 醬油中各有機(jī)酸色譜圖Fig.2 Chromatogram of organic acids in soy sauce

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)有機(jī)酸含量的影響

將發(fā)酵過(guò)程中取得樣品醬油進(jìn)行色譜分析，得到發(fā)酵時(shí)間對(duì)各有機(jī)酸濃度的影響結(jié)果，見圖3～圖8。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)草酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the content of oxalic acid in soy sauce

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)檸檬酸含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the content of citric acid in soy sauce

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒石酸含量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the content of tartaric acid in soy sauce

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蘋果酸含量的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the content of malic acid in soy sauce

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸含量的影響Fig.7 Effect of fermentation time on the content of lactic acid in soy sauce

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙酸含量的影響Fig.8 Effect of fermentation time on the content of acetic acid in soy sauce

由圖3～圖8可知，醬油中未檢出丙酮酸、甲酸；酒石酸出現(xiàn)在發(fā)酵初期，發(fā)酵后期醬油中的酒石酸濃度為0；丁二酸在發(fā)酵初期的醬油中未檢出，但在某些醬油的后期出現(xiàn)，并且濃度較高。檸檬酸、蘋果酸、乳酸和丁二酸的含量較高，草酸和乙酸的含量較低。

由圖3～圖8可知，草酸在發(fā)酵過(guò)程中變化不是很大，而檸檬酸和蘋果酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，酒石酸和乳酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，乙酸含量大致有先增加后下降的趨勢(shì)。

2.4 成熟醬油中有機(jī)酸含量與感官品評(píng)結(jié)果

10個(gè)成熟醬油樣品的有機(jī)酸檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 成熟醬油樣本中有機(jī)酸濃度Table 1 Concentration of organic acids in mature soy sauce samples g/L

10個(gè)樣品的感官品評(píng)結(jié)果見表2。

表2 成品醬油感官品評(píng)結(jié)果Table 2 Results of sensory evaluation of finished soy sauce

續(xù) 表

利用SPSS主成分分析法獲得醬油各項(xiàng)感官指標(biāo)和濃度的相關(guān)矩陣，其中醬油色澤與有機(jī)酸含量的關(guān)系見表3。

表3 成熟醬油色澤與有機(jī)酸濃度的相關(guān)矩陣Table 3 Correlation matrix of color and organic acids concentration of finished soy sauce

由表3可知，色澤特征值為1時(shí)，草酸的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值為0.116，檸檬酸的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值為0.641，酒石酸的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值為0，蘋果酸的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值為0.706，丙酮酸的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值為0，丁二酸的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值為0.664，乳酸的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值為0.635，甲酸的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值為0，乙酸的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值為0.492。

乳酸為負(fù)相關(guān)，其他均為正相關(guān)，其中蘋果酸、檸檬酸、丁二酸、乳酸對(duì)其影響較大，蘋果酸、檸檬酸、丁二酸對(duì)色澤有正面影響，乳酸對(duì)色澤有負(fù)面影響。

同樣的處理方式，各種有機(jī)酸同感官品嘗的具體指標(biāo)的關(guān)系如下：

體態(tài)：乳酸為正相關(guān)，其他均為負(fù)相關(guān)，其中檸檬酸和乳酸對(duì)體態(tài)影響較大，乳酸有正面影響而檸檬酸產(chǎn)生負(fù)面影響。

香氣：檸檬酸與乳酸為負(fù)相關(guān)，其他均為正相關(guān)，乳酸與丁二酸對(duì)其影響最大，乳酸對(duì)其有負(fù)面影響，丁二酸具有正面影響。

咸：草酸與乳酸為負(fù)相關(guān)，其余為正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)最大的為檸檬酸，蘋果酸、丁二酸也有較大的正面影響，乳酸、草酸對(duì)咸口感產(chǎn)生不大的負(fù)面影響。

香：乳酸為負(fù)相關(guān)，對(duì)醬油香氣有較大的負(fù)面作用，檸檬酸、蘋果酸均對(duì)香氣有較大的正面影響。

甜：乳酸為正相關(guān)其余均為負(fù)相關(guān)，其中蘋果酸對(duì)醬油甜味影響最大，為負(fù)面影響，草酸、檸檬酸、丁二酸均有較大的負(fù)面影響。

綿：乳酸為正相關(guān)，其余為負(fù)相關(guān)，檸檬酸與蘋果酸的相關(guān)系數(shù)最高且均為負(fù)面影響，草酸、丁二酸、乙酸均對(duì)綿口感有較小的正面影響。

鮮：草酸與乳酸為正相關(guān)，其余為負(fù)相關(guān)，其中乳酸對(duì)其影響最大且具有正面影響，其他有機(jī)酸對(duì)鮮味影響較小。

酸：乳酸為負(fù)相關(guān)，其余均為正相關(guān)，檸檬酸、蘋果酸、丁二酸產(chǎn)生不可忽視的正面影響，同時(shí)乳酸對(duì)酸口味產(chǎn)生較大負(fù)面影響。

澀：乳酸為負(fù)相關(guān)，其余均為正相關(guān)，且乳酸對(duì)減少貢獻(xiàn)最大，蘋果酸及丁二酸相關(guān)值分別位居第一和第二，極大限度增加了醬油澀的口感。

苦：乳酸為負(fù)相關(guān)，其余均為正相關(guān)，且乳酸的相關(guān)系數(shù)最大，有較大的負(fù)面影響，但檸檬酸、蘋果酸、丁二酸有較小的正面影響。

有機(jī)酸對(duì)感官品評(píng)的相關(guān)性見表4。

表4 有機(jī)酸與感官品評(píng)指標(biāo)的相關(guān)性Table 4 Correlation between organic acids and sensory evaluation indexes

注：“+”表示正相關(guān)，“-”表示負(fù)相關(guān)，“*”表示影響較大。

綜合以上分析，乳酸、檸檬酸和蘋果酸對(duì)醬油的品質(zhì)影響最大，同時(shí)這3種有機(jī)酸也是醬油中含量較高的酸，這與畢麗君等[7]的研究結(jié)果相一致。這3種有機(jī)酸對(duì)感官的各項(xiàng)指標(biāo)既有正面的影響，也有負(fù)面的影響，所以應(yīng)該有一個(gè)合理的水平。

由于本次實(shí)驗(yàn)只關(guān)注了3個(gè)樣本在發(fā)酵過(guò)程中的有機(jī)酸變化規(guī)律，樣本數(shù)量不足，得出的結(jié)論有待于進(jìn)一步確認(rèn)。