王丹，袁永俊，譚青云，黃河，蔣林利，彭潔，潘亞瑜

(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 611730)

鐵皮石斛又名黑節(jié)草，被譽(yù)為“藥中黃金”，具有極高的藥用和食用價(jià)值[1]。主要分布在我國(guó)溫暖的南方，如廣西、云南、浙江等地[2]，常用于陰傷津虧、口干煩渴、目暗不明等[3,4]。多糖是鐵皮石斛最重要的組成部分，其含量和活性決定了鐵皮石斛的品質(zhì)[5]。研究表明，鐵皮石斛多糖具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生理功能[6]。因此鐵皮石斛具有極高的食用價(jià)值，傳統(tǒng)食用方式為泡茶、煲湯、直接食用等。隨著精加工技術(shù)的發(fā)展和對(duì)功能性的重視，鐵皮石斛的應(yīng)用日益廣泛，近來(lái)將鐵皮石斛用于調(diào)味品如調(diào)味汁、醬油、料酒中，以增強(qiáng)調(diào)味品的營(yíng)養(yǎng)性和保健性，這為鐵皮石斛和調(diào)味市場(chǎng)提供了新的方向。

微生物含有豐富的酶系，具有分解轉(zhuǎn)換物質(zhì)及產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)的能力[7]。中藥的成分和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使得活性物質(zhì)被包裹，藥性不能得到完全釋放[8]。通過(guò)微生物發(fā)酵可以破壞細(xì)胞壁，促進(jìn)中藥活性物質(zhì)的釋放，降解有毒物質(zhì)，產(chǎn)生次生代謝物如多酚、黃酮等[9]。此外，微生物發(fā)酵還可以促進(jìn)活性成分的吸收[10]，提高有效成分的提取率。本文選用了幾種常見(jiàn)菌種，比較了不同菌種在發(fā)酵過(guò)程中多糖含量和多糖活性的變化，為提高鐵皮石斛生物活性和研制功能性保健食品提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛：市售；面包酵母、釀酒酵母：購(gòu)自安琪酵母股份有限公司；紅曲霉、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌：由本實(shí)驗(yàn)室提供；MRS肉湯培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基：購(gòu)自北京奧博生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、α-淀粉酶、3,5-二硝基水楊酸、Sephadex G-200、1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH)、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、Dextran系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(T-10、T-40、T-70、T-200、T-500)：購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、石油醚、硫酸、正丁醇、三氯甲烷、硫酸亞鐵、水楊酸、過(guò)氧化氫、過(guò)硫酸鉀等：購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠(chǎng)；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SF-130C萬(wàn)能粉碎機(jī) 吉首中誠(chéng)制藥機(jī)械廠(chǎng)；BZF-50真空干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司； SGSP-02電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱 湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；UV2400紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；GI54DWS全自動(dòng)高壓滅菌鍋 致微(廈門(mén))儀器有限公司；HNY-2012C制冷恒溫?fù)u床 天津市歐諾儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

1.3.1.1 酵母的活化

參考說(shuō)明書(shū)，將酵母用5倍以上的35～38 ℃ 2%糖水活化15～30 min。

1.3.1.2 乳酸菌的活化

將菌種接種于MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，連續(xù)傳代，使菌種充分活化至活菌數(shù)在1.0×108CFU/mL以上。

1.3.1.3 霉菌的活化

將菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d，使菌種充分活化。

1.3.2 鐵皮石斛發(fā)酵原液的制備

鐵皮石斛發(fā)酵原液的制備：參考文獻(xiàn)[11]，將鐵皮石斛粉末與蒸餾水以1∶30的比例進(jìn)行混合，攪拌均勻后置于恒溫水浴鍋中，90 ℃提取2 h，離心得到上清液。

鐵皮石斛發(fā)酵工藝：取150 mL水提液倒入250 mL錐形瓶中，用棉花塞密閉，115 ℃滅菌20 min后接種發(fā)酵，接種量為2%，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為170 r/min，發(fā)酵條件見(jiàn)表1。

表1 不同菌種發(fā)酵條件Table 1 Fermentation conditions of different strains

1.4 基本指標(biāo)的測(cè)定

還原糖含量的測(cè)定參考GB 5009.7-2016《食品中還原糖的測(cè)定》；多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法。

1.5 多糖分子量的測(cè)定[12]

樣品制備：將粗多糖水提液和發(fā)酵液經(jīng)過(guò)醇沉、脫蛋白[13]、脫色素和透析除雜得到高純度的多糖，冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

采用凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定鐵皮石斛多糖分子量。將Dextran T-500、T-200、T-70、T-40、T-10系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，上樣體積2 mL，不同濃度NaCl溶液梯度洗脫，流速0.8 mL/min，4 mL/管，苯酚-硫酸法追蹤檢測(cè)，以Ve/V0為縱坐標(biāo)，lgMr為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。曲線(xiàn)方程為：Y=0.4077X+3.3606，相關(guān)系數(shù)R2=0.9963。同樣條件下測(cè)定發(fā)酵前后樣品的洗脫體積，計(jì)算分子量。平均分子量的計(jì)算參考文獻(xiàn)[14]。

1.6 自由基清除能力的測(cè)定

1.6.1 羥基自由基(OH)清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[15]并加以改進(jìn)，向試管中依次加入2 mL 0.15 mmol/L FeSO4、0.8 mL 2 mmol/L水楊酸、0.4 mL樣液、2 mL 6 mmol/L H2O2和0.8 mL去離子水作為樣品組，37 ℃恒溫水浴 10 min，冷卻至室溫，去離子水作為調(diào)零管，510 nm 處測(cè)定吸光度。以去離子水代替樣液作為空白組，去離子水代替水楊酸作為對(duì)照組，計(jì)算公式如下：

OH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A對(duì)照)/A空白]×100。

1.6.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]并加以改進(jìn)，向試管中依次加入2 mL樣液和等體積的0.1 mmol/L DPPH溶液作為樣品組，常溫避光反應(yīng)30 min，以去離子水與95%乙醇等比例混合作為調(diào)零管，在517 nm處測(cè)定吸光度。以去離子水代替樣液作為空白組，95%乙醇代替DPPH溶液作為對(duì)照組，計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A對(duì)照)/A空白]×100。

1.6.3 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]，精密移取5 mL 7 mmol/L ABTS和88 μL 140 mmol/L過(guò)硫酸鉀進(jìn)行混合，常溫避光靜置過(guò)夜，形成ABTS自由基儲(chǔ)備液，適當(dāng)稀釋至734 nm處吸光值在0.7±0.02區(qū)間。向試管中加入0.4 mL樣液和6 mL ABTS溶液作為樣品組，用去離子水作為調(diào)零管，在734 nm處測(cè)定其吸光度。以去離子水代替樣液作為空白組，去離子水代替 ABTS 溶液作為對(duì)照組，計(jì)算公式如下：

ABTS自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A對(duì)照]/A空白)×100。

1.7 體外降血糖活性的測(cè)定

1.7.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定[18]

取1 U/mL α-葡萄糖苷酶50 μL、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)280 μL、樣液20 μL，37 ℃水浴10 min，再加入24 mmol/L PNPG 50 μL，37 ℃反應(yīng)15 min，最后加入0.2 mol/L Na2CO3終止液200 μL，于405 nm處測(cè)定吸光度，記為樣品實(shí)驗(yàn)組。以去離子水代替樣液作空白對(duì)照組，去離子水代替α-葡萄糖苷酶作樣品對(duì)照，其他步驟同上，測(cè)定樣品空白與樣品對(duì)照。利用下式計(jì)算發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[1-(A樣品實(shí)驗(yàn)-A樣品對(duì)照)/A樣品空白]×100。

1.7.2 α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定[19]

采用DNS法測(cè)定樣品對(duì)α-淀粉酶的抑制率。依次向試管中加入1 mL 1.0%可溶性淀粉、0.5 mL樣液和1 mL 1.0% α-淀粉酶，于37 ℃反應(yīng)30 min，再加入2 mL 1 mol/L NaOH和2 mL DNS試劑，在540 nm處測(cè)定吸光度，記為樣品實(shí)驗(yàn)組。用去離子水代替樣液作為空白對(duì)照，去離子水代替α-淀粉酶作樣品對(duì)照，其他步驟同上，測(cè)定樣品空白與樣品對(duì)照。利用下列公式計(jì)算α-淀粉酶抑制率。

α-淀粉酶抑制率(%)=[1-(A樣品實(shí)驗(yàn)-A樣品對(duì)照)/A樣品空白]×100。

2 結(jié)果

2.1 不同菌種發(fā)酵對(duì)鐵皮石斛活性成分的影響

2.1.1 不同菌種發(fā)酵對(duì)鐵皮石斛多糖含量的影響

表2 不同菌種發(fā)酵后鐵皮石斛多糖含量的變化Table 2 Polysaccharide content of Dendrobium candidum fermented by different strains %

由表2可知，與未發(fā)酵樣品相比，除米曲霉和紅曲霉外，發(fā)酵后多糖含量普遍降低。植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵后多糖含量明顯下降，分別下降了21.8%和17.3%，面包酵母和釀酒酵母減少量相對(duì)較少，可能是由于乳酸菌活力更強(qiáng)，消耗糖的能力更高。米曲霉發(fā)酵后多糖含量基本無(wú)變化，紅曲霉發(fā)酵后多糖含量增高，是因?yàn)榧t曲霉中酶系比較豐富，在發(fā)酵過(guò)程中將淀粉等其他物質(zhì)轉(zhuǎn)換為可溶性糖。

2.1.2 不同菌種發(fā)酵對(duì)鐵皮石斛還原糖含量的影響

表3 不同菌種發(fā)酵后鐵皮石斛還原糖含量的變化Table 3 Reducing sugar content of Dendrobium candidum fermented by different strains %

由表3可知，與未發(fā)酵空白相比，發(fā)酵后還原糖含量都有所降低，其中酵母發(fā)酵后還原糖含量減少最多，其次為乳酸菌，最后為曲霉，可能是由于酵母體內(nèi)無(wú)淀粉酶系，酵母的生長(zhǎng)直接消耗還原糖，且發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)代謝活動(dòng)旺盛，糖的消耗速度快。

2.1.3 不同菌種對(duì)鐵皮石斛多糖分子量的影響

由表4可知，采用6種不同菌種發(fā)酵后，多糖分子量均有一定程度的變化。其中酵母和乳酸菌發(fā)酵后多糖分子量顯著降低，曲霉發(fā)酵后多糖分子量小幅度增長(zhǎng)，可能是由于在發(fā)酵過(guò)程中酵母和乳酸菌產(chǎn)生的酶系使得大分子多糖降解，分子量降低。

表4 不同菌種發(fā)酵后鐵皮石斛多糖分子量的變化Table 4 Molecular weight of polysaccharide from Dendrobium candidum fermented by different strains

2.2 不同菌種發(fā)酵對(duì)抗氧化性的影響

2.2.1 不同菌種發(fā)酵對(duì)DPPH自由基清除率的影響

圖1 不同菌種發(fā)酵過(guò)程中DPPH·清除能力的變化Fig.1 Changes of DPPH· scavenging capacity during fermentation by different strains

由圖1可知，發(fā)酵后鐵皮石斛對(duì)DPPH自由基的清除能力有所提高，不同菌種在發(fā)酵0～6 d的過(guò)程中發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基的清除率總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。不同菌種由于發(fā)酵特性的差異使得其最佳發(fā)酵時(shí)間和DPPH自由基清除能力存在一定差異。相對(duì)而言，酵母和乳酸菌發(fā)酵到DPPH清除率最高時(shí)所需時(shí)間較短，可能是由于其延緩期較短。面包酵母發(fā)酵后其發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，可能是由于酵母發(fā)酵后多糖得到水解，裸露的羥基較多，使其抗氧化活性比發(fā)酵前多。

2.2.2 不同菌種發(fā)酵對(duì)OH 自由基清除率的影響

由圖2可知，發(fā)酵有助于增強(qiáng)鐵皮石斛對(duì)OH自由基的清除能力，不同菌種發(fā)酵后發(fā)酵液對(duì)OH自由基的清除能力高于其對(duì)DPPH自由基的清除能力，但總體變化趨勢(shì)與圖1近似相同，除個(gè)別菌種OH自由基清除率最高處所對(duì)應(yīng)的發(fā)酵時(shí)間有所不同。面包酵母發(fā)酵3天時(shí)發(fā)酵液對(duì)OH自由基的清除能力最強(qiáng)，達(dá)到38.2%。

圖2 不同菌種發(fā)酵過(guò)程中·OH清除能力的變化Fig.2 Changes of ·OH scavenging capacity during fermentation by different strains

2.2.3 不同菌種發(fā)酵對(duì)ABTS自由基清除率的影響

圖3 不同菌種發(fā)酵過(guò)程中ABTS自由基清除能力的變化Fig.3 Changes of ABTS free radical scavenging capacity during fermentation by different strains

由圖3可知，發(fā)酵后鐵皮石斛對(duì)ABTS自由基的清除率高于未發(fā)酵空白，菌種發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液對(duì)ABTS自由基清除能力的變化規(guī)律與DPPH和OH的變化趨勢(shì)近似相同，但是清除率最高點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的發(fā)酵時(shí)間有所差異。發(fā)酵液對(duì)ABTS自由基的清除率高于OH自由基低于DPPH自由基。紅曲霉發(fā)酵后發(fā)酵液對(duì)ABTS自由基的清除率最高，為32.8%，其次為面包酵母(31.2%)。由圖1～圖3可知，發(fā)酵可以提高鐵皮石斛的體外抗氧化能力，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵后鐵皮石斛多糖分子量下降，鮑素華等[20]研究表明抗氧化活性與分子量大小有關(guān)，分子量最低的DSP1對(duì) DPPH的清除作用、總抗氧化能力、抑制H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血和抑制Fe2+-VC誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化作用效果最佳，同時(shí)發(fā)酵可以使活性位點(diǎn)暴露并通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生黃酮等抗氧化物質(zhì)。

2.3 不同菌種發(fā)酵對(duì)體外降血糖活性的影響

2.3.1 不同菌種發(fā)酵對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響

由圖4可知，發(fā)酵液在0～6 d范圍內(nèi)對(duì)α-淀粉酶的抑制率隨著發(fā)酵時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。相比而言，紅曲霉發(fā)酵后對(duì)α-淀粉酶的抑制活性最強(qiáng)，在發(fā)酵第5天時(shí)，其對(duì)α-淀粉酶的抑制率最高，為22.6%，比未發(fā)酵空白提高了86.7%，可能是由于紅曲霉在發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)生的多酚、黃酮等次生代謝物具有較好的降血糖作用。

圖4 不同菌種發(fā)酵發(fā)酵過(guò)程中α-淀粉酶抑制率的變化Fig.4 Changes of α-amylase inhibition rate during fermentation by different strains

2.3.2 不同菌種對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

圖5 不同菌種發(fā)酵過(guò)程中α-葡萄糖苷酶抑制率的變化Fig.5 Changes of α-glucosidase inhibition rate during fermentation by different strains

由圖5可知，不同菌種發(fā)酵過(guò)程中α-葡萄糖苷酶抑制率的變化趨勢(shì)與3種自由基清除能力的變化規(guī)律十分相似，均先增加后降低且活性均高于發(fā)酵原點(diǎn)。與圖4相比，發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力更強(qiáng)。鐵皮石斛可以通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶活性來(lái)抑制糖類(lèi)分解成葡萄糖，同時(shí)阻止葡萄糖在腸道內(nèi)的吸收，最終達(dá)到降低血糖的目的，因此將天然綠色的鐵皮石斛多糖研制為降糖保健品具有可行性和市場(chǎng)需求性。發(fā)酵后的米曲霉和紅曲霉對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最大值分別為26.9%和27.7%。

3 結(jié)論

采用6種不同菌種發(fā)酵后，鐵皮石斛多糖含量和活性都有一定程度的變化。因?yàn)槲⑸镌谏L(zhǎng)過(guò)程中需要消耗糖，所以發(fā)酵后除曲霉外，其余菌種的多糖和還原糖均有所下降，且多糖分子量降低。發(fā)酵后，鐵皮石斛對(duì)自由基的清除能力和體外降血糖能力明顯提高，說(shuō)明發(fā)酵可以作為增強(qiáng)鐵皮石斛功能和開(kāi)發(fā)鐵皮石斛保健品的重要手段之一。其中面包酵母發(fā)酵后發(fā)酵液對(duì)自由基的清除能力最高，紅曲霉發(fā)酵后發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性最強(qiáng)。綜合考慮，紅曲和面包酵母可以明顯改善鐵皮石斛活性，且在調(diào)味品中應(yīng)用較為廣泛。因此，可在后續(xù)研究中考慮將鐵皮石斛加入發(fā)酵型調(diào)味品中，既可以為微生物生長(zhǎng)繁殖提供碳水化合物，也可以提高調(diào)味品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。