李瑞麗，嚴 寒，鄭小明，萬明春

（1.江西省農業(yè)科學院農產品質量安全與標準研究所，江西 南昌 330200；2.江西省玉山黑豬原種場，江西 上饒 334700；3. 江西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒引起的豬、牛等偶蹄目動物的一種急性傳染病，該病的發(fā)生與流行對畜牧業(yè)的影響極為嚴重，往往造成巨大的經濟損失。目前世界各國控制口蹄疫較為有效的辦法是采用疫苗接種，但是由于多種原因往往造成生產上口蹄疫疫苗免疫的效果不甚理想[1,2]。因此，提高疫苗的免疫效果成為迫切的需要，而免疫佐劑不僅能增強疫苗的免疫應答，而且能驅使動物機體獲得有效的保護性免疫。隨著近來對佐劑研究的深入，口服佐劑的研究越來越受到重視，因為口服免疫是一種簡單易接受的產生全身性免疫的方式，而且黏膜免疫在保護腸道和呼吸道黏膜表面的疫病方面也有主要作用。當然，天然藥物免疫佐劑開發(fā)也是另一個重點，中草藥免疫佐劑是指傳統(tǒng)中草藥或經過加工提取的含有生物活性物質具有增強機體免疫功能的現代中藥制劑[3,4]?，F有的研究已經證明，許多中草藥作為某些傳染病疫苗的佐劑已取得了理想的療效[5-10]。

白術為我國傳統(tǒng)中藥材，前期研究證明中藥白術能夠提高小鼠對于O 型口蹄疫疫苗的免疫反應[11]，本試驗進行了中藥白術對豬免疫口蹄疫疫苗的免疫效果的研究，為探索中藥白術的合理使用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

江西省某養(yǎng)殖場的30 日齡杜長大三元雜交豬50 頭。

1.2 試劑及儀器

豬口蹄疫O 型滅活疫苗（OZK/93 株，批 號：1012001）中牧實業(yè)股份有限公司生產；中藥白術（炒制）購自南昌市匯仁堂藥店；豬O 型口蹄疫病毒ELISA 抗體檢測試劑盒，購自武漢科前動物生物制品有限責任公司；Sorvall ST 16R型離心機，美國thermo fisher 公司制造；RE-3000 型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠制造；SHZ-III 型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠制造；SH-1000 型酶標儀，日本Corona Electric 公司制造；ASE350加速溶劑萃取儀，美國Dionex 公司制 造；Agilent 7890A-7000QqQ 型氣相色譜三重串聯四極桿質譜聯用儀，美國Agilent 公司制造。

1.3 中藥白術的制備

白術煎煮劑制備：白術500 g加水2 500 mL 水中浸泡30 min，然后置煎煮容器中，文火煎煮1 h，過濾去渣，再加水2 500 mL 文火煎煮1 h，合并煎液，于65 ℃旋轉蒸發(fā)，濃縮為相當于原生藥材4 g/mL 的藥液，全部原藥加入淀粉500 g，混合均勻后60 ℃烘干。

1.4 中藥白術的質量鑒定

用加速溶劑萃取-氣相色譜串聯質譜法測定白術煎煮劑中的白術內酯I 和白術內酯III 含量，方法參考Li R L 等人方法[11]。

1.5 試驗方法

50 頭30 日齡杜長大雜交豬，隨機分成5 組，每組10 頭，預飼期3 d，采血。然后進行飼喂試驗，按照空白對照（標準日糧）、I 組（標準日糧+0.5%粉碎白術），Ⅱ組（標準日糧+1.0%粉碎白術）、Ⅲ組（標準日糧+0.5%煎煮白術）和Ⅳ組（標準日糧+1.0%煎煮白術）進行飼喂，試驗期10 d。飼喂結束后12 h 進行稱重、免疫，每頭豬免疫1 mL 的O 型口蹄疫商品苗，第4 周進行二免，第7 周稱重、前腔靜脈采血。血樣室溫靜置于4 h 后，于4 ℃冰箱過夜，3 000 r/min 離心3 min，吸取血清分裝于0.2 mL 塑料離心管中，-20 ℃保存，檢測抗體水平。

1.6 統(tǒng)計分析

數據用xˉ±SD 表示，用SPSS軟件進行Duncan 檢驗，P<0.05 為差異顯著。

2 試驗結果與分析

2.1 中藥白術中白術內酯Ⅰ和白術內酯Ⅲ的含量

圖1 顯示了標準品（std-1 mg/kg.D）和中藥白術（huiren-1.D）中白術內酯Ⅰ和白術內酯Ⅲ的質譜圖，測定的試驗白術中白術內酯Ⅰ和白術內酯Ⅲ的含量分別為1 391.5 mg/kg 和960.1 mg/kg。

2.2 不同加工處理和劑量的白術對豬O 型口蹄疫疫苗的影響

圖1 白術內酯的離子掃描質譜圖

表1 顯示了豬口蹄疫O 型滅活苗免疫前和二免后3 周豬只的口蹄疫抗體檢測結果。由表1 可知免疫前試驗各組的口蹄疫抗體水平，對照組、Ⅰ組、Ⅲ組以及Ⅳ組的OD630nm值均＜0.2，低于試劑盒0.4的陽性標準，但是，Ⅱ組有6 頭豬的抗體水平較高，OD630nm平均值高于試劑盒0.4 的陽性標準，推測本組豬只的上述結果因為其母源抗體水平較高；與對照組的OD630nm值相比，Ⅰ組、Ⅲ組以及Ⅳ組差異均不顯著（P ＞0.05），但Ⅱ組的OD630nm值顯著高于對照組（P ＜0.05）。表1 中二免后3 周試驗各組的口蹄疫抗體水平的結果可以看出，I 組、Ⅲ組的OD630nm值均顯著高于對照組（P ＜0.05），Ⅳ組的OD630nm值與對照組相比差異不顯著（P ＞0.05）；Ⅲ組的OD630nm平均值最高，但與其他兩個中藥組差異不顯著（P ＞0.05），可見飼喂經不同加工處理的中藥白術對口蹄疫疫苗具有一定的免疫增強作用。此外，試驗中Ⅱ組由于母源抗體較高，二免后3 周OD630nm平均值低于試劑盒0.4 的陽性標準，由于情況比較特殊在這將不參與比較。

2.3 不同加工處理和劑量的白術對豬體增重及仔豬腹瀉率的影響

表2 列出了整個試驗過程中試驗豬只的體增重情況，試驗各組豬的體增重與對照組相比差異均不顯著（P ＞0.05），中藥組間豬只的體增重亦無明顯差異（P ＞0.05）。試驗過程中，對照組和試驗Ⅱ組均有1 頭仔豬出現了腹瀉。

3 討論

3.1 中藥白術對豬口蹄疫疫苗的免疫增強作用

白術作為一味補氣中藥已經在我國應用數千年，現代藥理學研究表明白術對免疫系統(tǒng)具有廣泛的免疫調節(jié)作用[12]。本試驗首先用氣相色譜串聯質譜的方法測定了白術中白術內酯Ⅰ和白術內酯Ⅲ的含量，分別為1 391.5 mg/kg 和960.1 mg/kg，可作為白術質量控制的重要依據。然后，進行免疫試驗，將不同處理方式和劑量的白術添加到試驗日糧中，飼喂10 d 后按正常免疫程序進行O 型口蹄疫疫苗免疫，二免3 周后進行抗體檢測。結果發(fā)現，除了白術Ⅱ組，其他試驗組的OD630nm值均高于對照組，其中飼喂添加了0.5%粉碎白術和0.5%煎煮白術的試驗豬的口蹄疫抗體水平與對照組比較差異顯著（P ＜0.05）。在本試驗中，由于采用口服的方式，未見明顯不良反應，對試驗豬體重的影響也不大。此結果與之前的小鼠試驗結果相吻合[11]，說明白術對口蹄疫疫苗的免疫具有一定的免疫增強作用。機體免疫應答是一個十分復雜的生物學過程，這一過程受機體免疫調節(jié)機制的控制。免疫調節(jié)機制不僅決定了免疫應答的發(fā)生與否，而且也決定了免疫應答的強弱。Jerne 于1974 年在“克隆選擇學說”的基礎上提出了“免疫網絡學說”，該學說認為抗原刺激發(fā)生之前，機體處于一種相對的免疫穩(wěn)定狀態(tài)，當抗原進入機體后打破這種平衡，引起具有抗原受體的細胞克隆活化增殖并產生特異性抗體，同時這種抗原反應細胞自身的Id 又可誘導相應的細胞克隆活化。關曉輝等[14]通過對腹腔巨噬細胞Fc 受體觀察，發(fā)現白術揮發(fā)油可以激活Fc 受體，經白術揮發(fā)油激活的巨噬細胞體積明顯增大，伸展能力強，表面結合的羊紅細胞顯著增多，從而增強機體非特異性免疫功能。宋海英等[15]通過定量溶血分光光度測定法指出白術能增強小鼠抗體形成細胞活性，促進B 細胞分化、增殖為漿細胞，增加小鼠血清IgG 含量。本試驗中飼喂白術之后，可能通過激活試驗豬的免疫細胞，增強了機體非特異性免疫功能，再對試驗豬注射口蹄疫疫苗時，就使得機體對抗原的免疫應答有所增強。

表1 免疫前后豬血清中O 型口蹄疫病毒的抗體水平

表2 免疫O 型口蹄疫疫苗對豬體增重的影響

3.2 母源抗體對口蹄疫疫苗的影響

本試驗發(fā)現，免疫疫苗前有一組豬只（33 日齡）的母源抗體水平較高，而且二免后3 周測定的抗體水平均不能達到試劑盒0.4的陽性標準。高世杰等[16]研究報告指出母源抗體對30 日齡前大部分仔豬特異抗體效價處于保護帶（lgX>1.8），45 日齡時，則有半數左右仔豬特異抗體效價處在灰色帶（lgX<0.9 ～1.8），他提出45 ～60日齡為接種口蹄疫疫苗的最佳時間。此外，Barteling[17]認為口蹄疫疫苗的免疫效果與疫苗抗原量、抗原毒株和佐劑有關，因此利用型內異源毒株免疫也是克服母源抗體干擾的途徑之一。

4 小結

0.5 %的煎煮或粉碎白術添加到基礎日糧飼喂10 d，可顯著提高O 型口蹄疫疫苗二免后3 周的FMD抗體水平，試驗豬未見明顯不良反應，對試驗豬體重的影響也不大。研究白術提高O 型口蹄疫疫苗的免疫效果的作用機理，尤其是對仔豬黏膜免疫的作用機制是下一步的工作重點。

生產中母源抗體對口蹄疫疫苗免疫失敗的影響也值得重視，采用合理的安排免疫時間和利用型內異源毒株免疫都是克服母源抗體干擾的途徑。