劉武剛，張海雷，周緒斌，曾容愚

（天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830001）

豬瘟(CSF)是一種由豬瘟病毒(CSFV)引起的烈性傳染病，也是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病。豬瘟病毒是黃病毒科瘟病毒屬的一種有囊膜的正股單鏈RNA 病毒。我國在20 世紀(jì)50 年代就研發(fā)了豬瘟兔化弱毒活疫苗(C 株)來預(yù)防豬瘟的暴發(fā)，取得較好的效果。近幾年來，由于我國的規(guī)?；i場(chǎng)已經(jīng)大規(guī)模的免疫了豬瘟活疫苗，使得豬瘟的流行特點(diǎn)已經(jīng)發(fā)生了顯著的變化，主要以非典型、亞急性、慢性或者隱形感染為主，主要表現(xiàn)為無臨床表現(xiàn)的母豬帶毒垂直傳播及豬群中水平傳播。母豬溫和型豬瘟臨床癥狀不明顯，但是帶毒豬會(huì)持續(xù)性地散毒，通過胎盤把病毒垂直傳播給仔豬，使得仔豬在胚胎時(shí)期就感染豬瘟病毒，造成其天然免疫耐受，在出生前就感染豬瘟病毒；并且水平傳播給沒有帶毒仔豬從而造成仔豬的發(fā)病死亡，這種母豬帶毒綜合征是目前豬場(chǎng)豬瘟控制不穩(wěn)定的主要原因[1]。豬瘟兔化弱毒疫苗已被證明可誘導(dǎo)對(duì)CSFV 感染產(chǎn)生完全的保護(hù)作用，并已廣泛用于控制豬的CSF，特別是在高度流行的地區(qū)。盡管如此，仍然有一些其他的因素影響現(xiàn)有豬瘟弱毒疫苗的免疫效果，從而導(dǎo)致免疫失敗，這些因素包括母源抗體水平[2,3]，接種時(shí)間[4]，接種方案，豬的日齡及與其他病原共感染等情況[5]。

在豬瘟的防控過程中，免疫抑制性疾病一直十分困擾養(yǎng)豬業(yè)。豬場(chǎng)尤其是規(guī)?；i場(chǎng)一旦感染免疫抑制性疾病，會(huì)很大程度影響豬瘟弱毒疫苗的免疫效果。多項(xiàng)研究表明PRRSV 可能對(duì)宿主免疫反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)作用。感染PRRSV 的豬通常表現(xiàn)為長時(shí)間的病毒血癥和持續(xù)性感染。S. Suradhat 通過試驗(yàn)證實(shí)在PRRSV 感染的急性期進(jìn)行豬瘟免疫可能導(dǎo)致疫苗接種失敗。PRRSV 可能是通過在感染初期宿主淋巴組織微環(huán)境中IL-10 的增多使體液免疫和細(xì)胞免疫功能受損，這也是PRRSV 可以抑制豬瘟免疫效果的原因。PRRSV 感染顯著抑制豬瘟疫苗效力的結(jié)果值得養(yǎng)豬業(yè)高度重視，特別對(duì)同時(shí)存在豬瘟和豬藍(lán)耳病流行的國家在進(jìn)行豬瘟免疫時(shí)具有很大的啟示[6]。

PCV2 是另一種中國豬場(chǎng)常見的免疫抑制性疾病，是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS)的主要原因之一。PCV2 感染能降低PRRSV 疫苗的保護(hù)效果，可以干擾宿主對(duì)豬偽狂犬病的免疫應(yīng)答。PCV2 介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活化干擾降低了體液免疫和CMI 的活化，也與CSFV 中和抗體的產(chǎn)生及抑制CSFV特異性細(xì)胞增殖有關(guān)。最新的研究顯示，如果豬場(chǎng)在接種疫苗前發(fā)生PCV2 感染，那么豬場(chǎng)CSFV 的感染壓力將顯著增加，豬場(chǎng)免疫CSFV疫苗對(duì)野毒的防治效果大大降低[7]。

1 豬場(chǎng)和豬群發(fā)病的背景

北京某規(guī)模化種豬場(chǎng)，存欄2 000 頭基礎(chǔ)母豬，從2017 年5 月份開始，出現(xiàn)40 ～50 日齡保育豬生產(chǎn)不穩(wěn)定，發(fā)病豬臨床表現(xiàn)為發(fā)燒，聚堆，被毛粗亂，關(guān)節(jié)腫大，倒地后四肢劃水，消瘦，其中倒地劃水的比例占30%，大部分豬存在淚斑，結(jié)膜炎。每批豬的發(fā)病率在20%～40%，死亡率10%～20%。剖檢癥狀主要表現(xiàn)為肺臟間質(zhì)性肺炎、腹股溝淋巴結(jié)呈大理石樣出血、腎臟溝壑加深變形、脾臟出現(xiàn)邊緣梗死等癥狀，詳細(xì)見圖1。

使用豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫前，豬場(chǎng)分離血清送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行豬瘟抗體測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果顯示，豬瘟抗體滴度非常低，4 周齡首免后，隨著仔豬周齡增加，豬瘟抗體阻斷率降低，離散度增大，陽性率降低，甚至到8 周齡，抗體平均阻斷率14.5%，離散度64.5%，陽性率0。具體檢測(cè)結(jié)果如圖2、圖3。

將場(chǎng)內(nèi)發(fā)病豬病料送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測(cè)，豬藍(lán)耳病病毒和豬圓環(huán)病毒核酸檢測(cè)結(jié)果為陽性，疑似場(chǎng)內(nèi)有豬藍(lán)耳病病毒和豬圓環(huán)病毒感染。具體檢測(cè)結(jié)果見表1。

2 疫苗試驗(yàn)應(yīng)用方法

圖1 發(fā)病豬只臨床表現(xiàn)以及解剖臨床癥狀

圖2 2018 年3 月豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫前生長豬豬瘟抗體平均阻斷率/離散度

圖3 2018 年3 月豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫前生長豬豬瘟抗體陽性率

表1 豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬偽狂犬病野毒、豬圓環(huán)病毒2 型核酸檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)組分為A/B 兩組，并做兩個(gè)重復(fù)，A 組分場(chǎng)進(jìn)行豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫，B 組分場(chǎng)進(jìn)行豬瘟ST 弱毒疫苗免疫，免疫途徑與免疫劑量按照疫苗說明書進(jìn)行。生長豬對(duì)比試驗(yàn)時(shí)，A 組分場(chǎng)連續(xù)兩批次免疫豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗，B 組分場(chǎng)免疫豬瘟ST疫苗，按照仔豬豬瘟免疫程序進(jìn)行，28 日齡第1 次免疫，63 日齡第2 次免疫。種豬群對(duì)比試驗(yàn)時(shí)，按照種豬群豬瘟普免免疫程序進(jìn)行，A 組分場(chǎng)全場(chǎng)免疫豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗，B 組分場(chǎng)免疫豬瘟ST疫苗。試驗(yàn)豬的飼養(yǎng)管理以及其他疫苗免疫均按本場(chǎng)原有程序進(jìn)行，試驗(yàn)期間如有明顯疾病發(fā)生，如嚴(yán)重腹瀉，肢體傷殘等，均予以淘汰。

3 采血與檢測(cè)

生長豬每組在首免后4 周進(jìn)行采血。種豬群每組按胎次免疫后1個(gè)月隨機(jī)抽取35 頭采血。利用豬瘟阻斷ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)豬瘟抗體。

4 判定標(biāo)準(zhǔn)

豬瘟抗體ELISA 檢測(cè)成立條件：陰性對(duì)照的平均OD450應(yīng)大于0.50。陽性對(duì)照的阻斷率應(yīng)大于50%。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：如果被檢樣本的阻斷率大于或等于40%，該樣本就可以被判為陽性(有CSFV 抗體存在)。如果被檢樣本的阻斷率小于或等于30%，該樣本就可以被判為陰性(無抗CSFV 抗體存在)。如果被檢樣本的阻斷率在30%～40%之間，就應(yīng)在數(shù)日后再對(duì)該動(dòng)物進(jìn)行重測(cè)。如果重測(cè)結(jié)果仍為可疑，就應(yīng)用血清中和試驗(yàn)方法鑒定。

5 試驗(yàn)結(jié)果

1)生長豬方面，同等條件下進(jìn)行免疫對(duì)比，連續(xù)2 批。豬藍(lán)耳病病毒感染，豬圓環(huán)病毒感染對(duì)豬瘟ST 疫苗和豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗的影響見圖4。試驗(yàn)前，檢測(cè)生長豬免疫豬瘟ST 疫苗效果見圖2和圖3，4 周齡首免后，一直檢測(cè)到8 周齡，平均抗體阻斷率逐漸下降，到8 周齡時(shí)為14.5%，陽性率為0，雖然對(duì)比試驗(yàn)中，首免后4 周，第一批次平均阻斷率42.69%，陽性率60%。第二批次平均阻斷率33.99%，陽性率44%，比試驗(yàn)前摸底數(shù)據(jù)有好轉(zhuǎn)，但仍然受豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒感染導(dǎo)致抗體不理想。然而，豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫組，首免后4 周，第一批次平均阻斷率73.68%，陽性率100%。第二批次平均阻斷率71.22%，陽性率93%。數(shù)據(jù)表明，豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗受豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒感染影響較小，可減少豬只豬瘟的免疫空窗期。

圖4 2018 年4 月生長豬豬瘟抗體檢測(cè)對(duì)比

圖5 2018 年5月種豬豬瘟抗體檢測(cè)對(duì)比

2)種豬群方面，同等條件下進(jìn)行免疫對(duì)比，豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免后1 個(gè)月平均阻斷率92.82%～95.40%，離散度≤7.69%，豬瘟ST 苗免疫后1 個(gè)月平均阻斷率82%～88%，離散度7.84%～22.86%。種豬群使用后對(duì)比，平均阻斷率有了進(jìn)一步的提高，離散度有了進(jìn)一步的降低，總之，豬瘟抗體的免疫效果有了進(jìn)一步的提升。具體數(shù)據(jù)如圖5。

3)生產(chǎn)成績提升，從3 月份開始更換豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗，全群換苗2 個(gè)月后，從5 月份開始，保育階段仔豬育成率持續(xù)保持97%及以上。平均日增重也有了明顯增高，最高可達(dá)119 g/d，生產(chǎn)成績有了明顯的提升。具體數(shù)據(jù)如圖6。

6 討論

從20 世紀(jì)50 年代中國研發(fā)成功舉世聞名的豬瘟兔化弱毒疫苗(即C 株)，該疫苗被公認(rèn)為是最有效的豬瘟疫苗，但關(guān)于C 株疫苗在機(jī)體內(nèi)的作用機(jī)制，仍然還沒有完全研究透徹。而S. Suradhat等在2005 年的發(fā)表文章中已證明PRRSV 感染可嚴(yán)重影響了豬只對(duì)CSFV 抗體反應(yīng)的誘導(dǎo)[9]。并且Yu-Liang Huang 等的研究表明了PCV2的感染降低了LPC 豬瘟疫苗的免疫效果，不僅可以干擾CSFV 野毒侵入養(yǎng)豬場(chǎng)，而且也增加了CSF 流行區(qū)CSF 防治的難度[10]。

如圖2 數(shù)據(jù)顯示，感染豬藍(lán)耳病病毒和豬圓環(huán)病毒，導(dǎo)致豬瘟弱毒疫苗4 周齡首免后，一直檢測(cè)到8 周齡，平均抗體阻斷率逐漸下降，到8 周齡時(shí)為14.5%，陽性率為0，雖然對(duì)比試驗(yàn)中，首免后4周，第一批次平均阻斷率42.69%，陽性率60%。第二批次平均阻斷率33.99%，陽性率44%，比試驗(yàn)前摸底數(shù)據(jù)有好轉(zhuǎn)，但仍然受豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒感染導(dǎo)致抗體不理想(見圖4)。這也解釋了目前保育、育肥豬群豬瘟抗體水平低下的原因。

豬瘟病毒囊膜糖蛋白E2 是豬瘟病毒的主要的保護(hù)性抗原蛋白，單獨(dú)免疫E2 蛋白即可避免豬感染豬瘟病毒。E2 蛋白上的中和性表位在 CSFV 毒株中相對(duì)保守，使得針對(duì)E2 蛋白基礎(chǔ)上開發(fā)的亞單位疫苗不僅廣泛地保護(hù)豬對(duì)抗CSFV 野毒株，而且可以通過檢測(cè)抗 Ems 的抗體將免疫和感染的豬區(qū)分開[8]，這就為豬瘟的凈化開辟了新的途徑。E2 蛋白已被證實(shí)是一個(gè)有效的可刺激機(jī)體產(chǎn)生主要中和抗體的免疫蛋白，并且文中研究結(jié)果表明，在豬群受豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒2 型感染的情況下，豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫并未受到明顯干擾，首免后4 周，第一批次平均阻斷率73.68%，陽性率100%。第二批次平均阻斷率71.22%，陽性率93%(見圖4)。

圖6 左圖保育階段3-10 月份育成率，右圖保育階段3-10 月份平均日增重

豬瘟E2 基因工程亞單位疫苗免疫效果明顯優(yōu)于豬瘟ST 苗，可以突破免疫抑制的限制，在豬群存在豬藍(lán)耳病和豬圓環(huán)病毒病等免疫抑制性疾病的情況下，仍可以穩(wěn)定提高豬瘟抗體水平，提供有效保護(hù)，提升生產(chǎn)成績，這就為復(fù)雜豬病形勢(shì)下豬瘟的防控提供了新的工具和方法。