趙靈琴 壽華鋒 陳 魯 高 雯 方晨燕 張 平#

1 中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 浙江 杭州 310022

2 浙江省腫瘤醫(yī)院 浙江 杭州 310022

3 浙江省人民醫(yī)院 浙江 杭州 310014

卵巢癌是目前女性生殖系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤，5年生存率僅為25%[1]。手術(shù)聯(lián)合化療仍是臨床首要治療方法，中醫(yī)藥在防治腫瘤有著悠久歷史，人參是一味名貴中藥，具有補(bǔ)氣固脫、健脾益肺、寧心益智、養(yǎng)血生津等作用。人參皂苷Rg3是從人參中的提取物四環(huán)三萜皂苷,研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3能夠有抑制腫瘤細(xì)胞增殖及浸潤轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制新生血管形成等多種抗腫瘤作用[2]。然而目前關(guān)于人參皂苷Rg3對卵巢癌細(xì)胞相關(guān)研究仍較少。本研究擬培養(yǎng)原代卵巢癌細(xì)胞，觀察人參皂苷Rg3對卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移能力及凋亡情況，了解其體外抗卵巢癌作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器：卵巢癌原代細(xì)胞來源于本院卵巢癌手術(shù)標(biāo)本；人參皂苷Rg3購于吉林亞泰制藥有限公司，批號：Z20180055；CCK8試劑盒購于上海東仁化學(xué)，批號：LF566；流失細(xì)胞儀：BD biosciences；CO2培養(yǎng)箱、超凈臺：美國Thermo公司。

1.2 細(xì)胞原代分離與培養(yǎng)：將卵巢癌組織塊加入含10%雙抗的PBS清洗3次，每次5min，培養(yǎng)基清洗1次，去除雜質(zhì)后將組織剪碎分離成0.5～1mm3的小塊加入原代細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天后更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞密度為80%～90%時，用胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞傳代，直到肉眼已無法觀察到成纖維細(xì)胞，并能持續(xù)傳代穩(wěn)定生長。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將處于對數(shù)分裂期的細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)，按5000個/孔在96孔板上接種卵巢癌原代細(xì)胞，加入（0、25、50、100、200、500μg/ml)濃度的Rg3，分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24及48h后，按CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行操作檢測OD值。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將原代細(xì)胞按照5×105密度鋪成六孔板，待細(xì)胞長滿后換無血清培養(yǎng)基并混合（0、50、100、200μg/ml）濃度的Rg3，并用槍頭劃線。按照0、12及24h取樣，拍照。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：原代細(xì)胞經(jīng)過不同濃度（0、50、100、200μg/ml)Rg3處理后，500μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞,然后加入5μl Annexin V/FITC和10μl PI,混勻后避光孵育5min，1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料應(yīng)用t檢驗(yàn)評價實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rg3對卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響：CCK8結(jié)果顯示，卵巢癌細(xì)胞隨著Rg3濃度的增加抑制率顯著增加，抑制率呈濃度梯度，在200μg/ml抑制最顯著（P＜0.01），且在24、48h均顯著被抑制。見圖1。

圖1 Rg3對卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 Rg3對卵巢癌細(xì)胞遷移能力的影響：劃痕結(jié)果顯示不同濃度Rg3干預(yù)12、24h后，卵巢癌細(xì)胞遷移能力較空白對照組均顯著減弱，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2A、B。

注：與空白對照組比較，**P＜0.01

2.3 Rg3對卵巢癌細(xì)胞凋亡水平的影響：流式細(xì)胞儀凋亡檢測結(jié)果顯示，Rg3各劑量干預(yù)組細(xì)胞凋亡水平較空白對照組均有不同程度的增加，見圖3A，且統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示Rg3（50、100、200μg/ml）劑量組細(xì)胞凋亡水平較空白對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），見圖3B。

圖3 Rg3對卵巢癌細(xì)胞凋亡水平的影響

3 討論

卵巢癌嚴(yán)重威脅女性健康，其早期癥狀無特異性，病情進(jìn)展迅速，且我國卵巢癌的發(fā)病率一直居高不下[3]。目前治療方法以手術(shù)聯(lián)合化療為主，但化療藥物毒副作用大，且治療方案的不斷改進(jìn)仍無法顯著提高患者生存率，靶向藥物作為目前癌癥治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)，其療效與患者個體的基因突變相關(guān)，且價格較為昂貴，療效亟待提高。

中醫(yī)藥在防治腫瘤方向具有悠久歷史和顯著療效，卵巢癌屬于中醫(yī)學(xué)“癥瘕”“腸覃”“積聚”范疇，最早記載于《素問·骨空論》中“任脈為病……女子帶下癥聚”。許多中藥及其提取物對腫瘤細(xì)胞具有明顯抑制作用[4-5]。人參皂苷Rg3是人參中的四環(huán)三萜皂苷,研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3對腫瘤細(xì)胞增殖和浸潤具有抑制作用，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤新生血管形成等作用[6]。本研究結(jié)果顯示卵巢癌細(xì)胞抑制率隨著Rg3濃度的增加顯著提高，且抑制率呈現(xiàn)濃度梯度趨勢，不同濃度Rg3干預(yù)12、24h后，卵巢癌細(xì)胞遷移能力顯著減弱，細(xì)胞凋亡水平均有不同程度增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示人參皂苷Rg3能有效抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，且調(diào)控作用與Rg3濃度呈劑量依賴性。

但本文尚未對卵巢癌裸鼠模型等動物層面進(jìn)一步研究人參皂苷Rg3的抗卵巢癌作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步對以上方面進(jìn)行深入探討。