邢麗紅，鄭關(guān)超，彭吉星，孫偉紅，孫曉杰，郭萌萌，吳海燕，李兆新，翟毓秀

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所； 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(青島), 山東 青島 266071)

孔雀石綠(malachite green，MG)，又稱中國綠、苯胺綠、堿性孔雀石綠、品綠和鹽基塊綠，是一種人工合成的N-甲基二氨基三苯基甲烷類染料，同時也是一種可有效殺滅霉菌的染料類藥物，對真菌和寄生蟲均有較好的殺滅效果[1]，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用。MG是含有3個芳香胺結(jié)構(gòu)的聚合物，具有潛在致癌、致畸和致突變作用[2-4]。MG進入機體后經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化，代謝成為無色脂溶性代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠(leucomalachite green，LMG)，長期滯留在組織中，因此，在水產(chǎn)品組織中檢測到的殘留物主要是LMG。出于安全性考慮，美國、加拿大、日本和歐盟等許多國家和地區(qū)已禁止在經(jīng)濟魚類(觀賞魚除外)養(yǎng)殖過程中使用MG。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號[5]已將MG列為禁用藥物，規(guī)定在水產(chǎn)品中對其“不得檢出”。中國從2002年開始對水產(chǎn)品藥物殘留實施監(jiān)控計劃，MG檢測結(jié)果的準確性和科學(xué)性不僅關(guān)系著生產(chǎn)者的利益，更關(guān)系到水產(chǎn)品質(zhì)量安全執(zhí)法部門的公正性。因此，探究LMG在水產(chǎn)品基質(zhì)樣品中的穩(wěn)定性對正確評估檢測結(jié)果至關(guān)重要。

MG會在生物體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)化，被還原成LMG，進一步與蛋白、DNA結(jié)合[6-8]。MG和LMG在斑點叉尾鮰(IctalurusPunctatus)[9]、鯰(Ictaluruspunctatus)[10]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[11]、鱖(Sinipercachuatsi)[12-15]、鯽(Carassiusauratus)[16]、花鱸(Lateolabraxmaculatus)[17]和凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[18]等體內(nèi)的代謝規(guī)律已有報道，研究結(jié)果表明，MG和LMG總含量在水產(chǎn)動物體內(nèi)殘留時間較長，數(shù)月后在組織中仍有檢出，且MG消除快于LMG。

關(guān)于保存條件對基質(zhì)中MG和LMG降解規(guī)律影響的研究還較少。黃向榮等[19]對不同儲藏條件下鱖(Sinipercachuatsi)肌肉中MG及LMG的降解規(guī)律進行研究，發(fā)現(xiàn)貯存溫度對肌肉中MG和LMG代謝的影響較大，降解速率為常溫>冷藏>冷凍。高麗娜等[20]開展了冷凍貯藏時間對鯉(Cyprinuscarpio)、鰻鱺(Anguillajaponica)和鱖(Sinipercachuatsi)肌肉中MG(LMG)殘留量的影響研究，結(jié)果表明，在相同貯藏時間下,鰻鱺組織中添加MG(LMG)降解速率最慢，鱖次之，鯉最快，分析原因可能是由于鰻鱺組織脂肪較多，其結(jié)合方式影響了MG(LMG)的降解。

近期在實驗室操作中發(fā)現(xiàn)，LMG在水產(chǎn)品基質(zhì)中的穩(wěn)定性可能還受到基質(zhì)品種等其他因素的影響。為探明LMG在水產(chǎn)品中的穩(wěn)定性是否與基質(zhì)品種等因素相關(guān)這一問題，綜合考慮MG在魚體中快速降解為LMG的客觀實情，本研究選取鯉(Cyprinuscarpio)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)兩種基質(zhì)，重點考察了LMG在兩種空白基質(zhì)樣品中的穩(wěn)定性，同時開展了加標后貯存溫度、時間等因素對LMG穩(wěn)定性的影響研究，旨在為正確評估LMG在水產(chǎn)品中的檢出結(jié)果提供依據(jù)，同時為今后相關(guān)部門實施城市水產(chǎn)品例行監(jiān)測、產(chǎn)地監(jiān)督抽查、苗種監(jiān)督檢測及以添加方式開展能力驗證和數(shù)據(jù)比對提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品

基質(zhì)A為鰱魚糜基質(zhì)；基質(zhì)A-0 M：新鮮的鰱魚糜基質(zhì)；基質(zhì)A-1 M、A-2 M、A-3 M、A-4 M和A-5 M：于-20 ℃分別冷凍貯存1、2、3、4和5個月的鰱魚糜基質(zhì)?；|(zhì)B為鯉魚糜基質(zhì)；基質(zhì)B-0 M：新鮮的鯉魚糜基質(zhì)；基質(zhì)B-1 M、2 M、3 M、4 M和5 M：于-20 ℃分別冷凍貯存1、2、3、4和5個月的鯉魚糜基質(zhì)。將新鮮鰱魚糜和鯉魚糜基質(zhì)樣品分裝成若干小包裝，于-20 ℃冷凍貯存?zhèn)溆?，檢測前自然解凍。

1.1.2 材料和試劑

LMG標準品(CAS:129-73-7)，購自Dr. Ehrentorfer GmbH公司，純度為99.63%；乙腈、甲酸和乙酸銨(均為色譜純)購自德國Merck公司；中性氧化鋁固相萃取柱(1 g/3 mL)購自博納艾杰爾科技有限公司。

LMG標準儲備液：準確稱取適量LMG標準品，用乙腈稀釋并定容，配制成0.5 mg/mL儲備液。實驗時根據(jù)需要稀釋使用。

LMG-D6內(nèi)標標準儲備液：準確稱取適量LMG-D6標準品，用乙腈稀釋并定容，配制成0.5 mg/mL內(nèi)標標準儲備液。實驗時稀釋成100 ng/mL內(nèi)標標準使用液。

1.1.3 儀器和設(shè)備

LC20液相色譜儀購自日本島津公司；AB Sciex Qtrap 5500 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)，購自美國AB Sciex公司；分析天平(精度為0.01 g)購自德國賽多利斯集團；himac CR 22 GII高速離心機購自日本Hitachi公司；KQ-600DE超聲波清洗儀購自昆山市超聲儀器有限公司；Gradient A10 Mill-Q超純水儀購自美國Millipore公司；N-EVAP 112氮氣吹干儀購自美國Organomation 公司；Standard Vortex Mixter渦旋混合器購自美國Talboys公司；Visiprep 24 DL固相萃取裝置購自美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基質(zhì)品種和空白基質(zhì)貯存時間對LMG測定結(jié)果的影響

模擬能力驗證樣品制備過程，分別稱取A-0 M～A-5 M的鰱空白基質(zhì)和B-0 M～B-5 M的鯉空白基質(zhì)各5.00 g，在空白基質(zhì)中添加LMG標準溶液(添加水平為2.1 μg/kg)，充分渦旋混合1 min后，先將其在室溫下保存2 h，再置于-20 ℃條件下保存16 h，測定LMG殘留量，考察基質(zhì)品種及空白基質(zhì)貯存時間對LMG測定結(jié)果的影響。

1.2.2 加標后貯存溫度和貯存時間對LMG測定結(jié)果的影響

取空白基質(zhì)A-0 M、A-1 M、A-3 M和B-0 M、B-1 M、B-3 M，每種基質(zhì)各取4份，每個樣品稱取5.00 g，分別添加LMG標準溶液(添加濃度為2.1 μg/kg)。取加標后的6種基質(zhì)樣品，每種基質(zhì)各取兩份，分別置于室溫(22～23 ℃)和冷藏(2～6 ℃)條件下，考察加標后樣品在室溫和冷藏條件下分別保存0、1、2、4、6和8 h后LMG的回收率。取加標后6種基質(zhì)樣品的剩余兩份樣品，分別置于-12 ℃和-20 ℃冷凍條件下，考察加標后樣品不同冷凍條件下分別保存0、8、16、24、32和40 h后LMG的回收率。每個時間點設(shè)6個重復(fù)。

1.2.3 稱樣與加標間隔時間對LMG測定結(jié)果的影響

稱取空白基質(zhì)A-0 M和空白基質(zhì)A-3 M，將該空白基質(zhì)樣品先置于-20 ℃條件下分別保存0、1、2、3、4和5 d，取出后室溫放置至解凍，添加LMG標準溶液(添加濃度為2.1 μg/kg)，再置于-20 ℃條件下保存16 h，測定LMG殘留量，考察基質(zhì)樣品稱取與加標間隔時間對LMG測定結(jié)果的影響。

1.3分析方法

1.3.1 樣品前處理

樣品前處理按照GB/T 19857—2005[21]中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法處理。

1.3.2 色譜條件

色譜柱選用Phenomenex C18色譜柱，100.0 mm×2.1 mm，粒徑3 μm；柱溫35 ℃，進樣量5 μL。流動相A為5 mmol/L乙酸銨(含0.05%甲酸)，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

Tab. 1 Gradient elution program of the mobile phase

時間/minTime?(A)/%?(B)/%流速/(mL·min-1)Speedrate0.0040600.351.5040600.353.005950.355.005950.355.1040600.357.0040600.35

注：A為5 mmol·L-1乙酸銨(含0.05%甲酸)，B為乙腈。φ(A)為流動相A體積分數(shù)，φ(B)為流動相B體積分數(shù)。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源采用電噴霧離子源，正離子模式；噴霧電壓(CUR)5 500 V；離子源溫度(TEM) 550℃；碰撞氣(CAD)Medium；氣簾氣(CUR)35 psi；霧化器(Gas1)50 psi；輔助加熱氣(Gas2)50 psi；去簇電壓(DP)80 V；射入電壓(EP)10 V；碰撞室射出電壓(CXP)10 V。掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，多反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量(CE)見表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量

Tab.2 Lists of selected MRM ion pairs and collision energy

目標化合物Targetcompound母離子(m/z)Parention子離子(m/z)Daughterion碰撞能量/eVCollisionenergyLMG331.2239.2?40316.225LMG-D6337.2240.2?40

注：*為定量碎片離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)品種和空白基質(zhì)貯存時間對測定結(jié)果的影響

新鮮基質(zhì)(A-0 M、B-0 M)和-20 ℃冷凍貯存1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5個月的鰱和鯉基質(zhì)(A-1 M～5 M、B-1 M～5 M)加標后(添加水平為2.1 μg/kg)，按照1.2.1和1.3的方法處理并測定LMG殘留量，計算回收率，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，新鮮鯉基質(zhì)(B-0 M)和冷凍貯存1～5個月的鯉基質(zhì)(B-1 M～B-5 M)，LMG的回收率均>90%，冷凍貯存5個月以內(nèi)的鯉基質(zhì)對LMG測定結(jié)果影響較小。新鮮鰱基質(zhì)(A-0 M)和冷凍貯存1個月的鰱基質(zhì)(A-1 M)，LMG的回收率均>90%。由此可知，冷凍貯存1個月的鰱基質(zhì)(A-1 M)對LMG測定結(jié)果影響較小。然而，當(dāng)鰱基質(zhì)冷凍貯存2個月(A-2 M)時LMG回收率降為76.9%，與新鮮的(A-0 M)和冷凍貯存1個月的鰱基質(zhì)(A-1 M)相比，回收率降低了近30%。冷凍貯存3個月的鰱基質(zhì)(A-3 M)，LMG的回收率僅為30.7%，冷凍貯存至5個月(A-5 M)時，回收率則降至12.4%。

圖1 基質(zhì)品種和空白基質(zhì)貯存時間對LMG測定結(jié)果的影響(n=6)Fig.1 Effects of matrix on the LMG results(n=6)

從兩種基質(zhì)的實驗結(jié)果來看，用鯉作為基質(zhì)的測定結(jié)果相對比較穩(wěn)定，鰱基質(zhì)隨著貯存時間的延長，LMG的回收率逐漸下降，在貯存2個月后，鰱基質(zhì)中LMG的回收率降至80%以下。由此可見，基質(zhì)品種及空白基質(zhì)貯存時間對LMG測定結(jié)果有重要影響。

2.2 加標后貯存溫度和貯存時間對LMG測定結(jié)果的影響

根據(jù)2.1的實驗結(jié)果，選取新鮮的(A-0 M、B-0 M)和冷凍貯存1個月及3個月的鰱、鯉基質(zhì)(A-1 M、A-3 M、B-1 M和B-3 M)為代表開展貯存溫度和時間對LMG測定結(jié)果的影響研究。

2.2.1 室溫和冷藏保存對LMG測定結(jié)果的影響

1)室溫和冷藏保存對鰱基質(zhì)中LMG測定結(jié)果的影響

在基質(zhì)A-0 M、A-1 M、A-3 M中添加LMG標準溶液后，分別在室溫(22～23 ℃)和冷藏(2～6 ℃)條件下保存0～8 h，該保存條件下鰱基質(zhì)中LMG隨保存時間的變化趨勢見圖2。

由圖2可知，不同鰱基質(zhì)隨室溫和冷藏保存時間的延長，均呈現(xiàn)出不同程度的下降趨勢。新鮮的鰱基質(zhì)(A-0 M)和冷凍貯存1個月的鰱基質(zhì)(A-1 M)不論在室溫還是冷藏條件下保存8 h，回收率均在90.0%～110.0%之間，對LMG測定結(jié)果影響較小。而冷凍貯存3個月的鰱基質(zhì)(A-3 M)在室溫和冷藏保存條件下，LMG的回收率均出現(xiàn)較大程度下降，且在室溫下的下降速率較冷藏條件下更快，當(dāng)在室溫條件下保存超過1 h、冷藏條件下保存超過2 h時，LMG的回收率均<70%，無法滿足方法準確度的要求。由此可知，采用冷凍貯存3個月的鰱基質(zhì)(A-3 M)進行添加回收率實驗，會嚴重影響LMG測定結(jié)果。

2)室溫和冷藏保存對鯉基質(zhì)中LMG的影響

在基質(zhì)B-0 M、B-1 M、B-3 M中添加LMG標準溶液后，分別在室溫(22～23 ℃)和冷藏(2～6 ℃)條件下保存0～8 h，該保存條件下鯉基質(zhì)中LMG隨保存時間的變化趨勢見圖3。

圖2 室溫(a)和冷藏保存(b)鰱基質(zhì)中LMG的變化趨勢(n=6)Fig. 2 Curves of LMG in Hypothalmichthys molitrix stored at room temperature(a) and refrigeration(b)(n=6)

圖3 室溫(a)和冷藏保存(b)鯉基質(zhì)中LMG的變化趨勢(n=6)Fig.3 Curves of LMG in Cyprinus carpio stored at room temperature and refrigeration(n=6)

由圖3可知，新鮮的鯉基質(zhì)(B-0 M)不論在室溫還是冷藏條件下保存8 h，回收率均穩(wěn)定在90.0%～110.0%之間，對LMG測定結(jié)果基本無影響。冷凍貯存1個月(B-1 M)和冷凍貯存3個月(B-3 M)的鯉基質(zhì)，在室溫和冷藏條件下均呈現(xiàn)出較小程度的下降趨勢，在室溫下的下降速率較冷藏條件下快。冷凍貯存3個月的鯉基質(zhì)(B-3 M)，LMG在室溫和冷藏條件下的回收率仍在90%以上，對LMG測定結(jié)果的影響較小。

2.2.2 冷凍保存對LMG測定結(jié)果的影響

1)冷凍保存對鰱基質(zhì)中LMG測定結(jié)果的影響

在基質(zhì)A-0 M、A-1 M、A-3 M中添加LMG標準溶液后，分別在-12 ℃和-20 ℃條件下保存0～40 h，該保存條件下鰱基質(zhì)中LMG隨保存時間的變化趨勢見圖4。

圖4 -12 ℃(a)和-20 ℃(b)冷凍保存鰱基質(zhì)中LMG的變化趨勢(n=6)Fig.4 Curves of LMG in Hypophalmichthys molitrix stored at -12 ℃(a) and -20 ℃(b)(n=6)

由圖4可知，不同貯存時間的鰱基質(zhì)添加LMG標準溶液后，隨冷凍保存時間的延長，亦呈現(xiàn)出不同程度的下降趨勢。新鮮的鰱基質(zhì)(A-0 M)和冷凍貯存1個月的鰱基質(zhì)(A-1 M)，加標后在-12 ℃和-20 ℃條件下保存40 h，LMG的回收率均在90.0%～110.0%之間，對LMG測定結(jié)果影響較小。而冷凍貯存3個月的鰱基質(zhì)(A-3 M)，加標后在-12 ℃和-20 ℃條件下保存40 h，LMG的回收率同樣出現(xiàn)較大程度的下降，且-12 ℃較-20 ℃保存時下降速率更快。冷凍貯存3個月的鰱基質(zhì)(A-3 M)，加標后樣品冷凍時間超過8 h，LMG的回收率均<70%，無法滿足方法準確度的要求。

2)冷凍保存對鯉基質(zhì)中LMG測定結(jié)果的影響

在基質(zhì)B-0 M、B-1 M、B-3 M中添加LMG標準溶液后，分別在-12 ℃和-20 ℃條件下保存0～40 h，該保存條件下鯉基質(zhì)中LMG隨保存時間的變化趨勢見圖5。

圖5 -12 ℃(a)和-20 ℃(b)冷凍保存理基質(zhì)中LMG的變化趨勢(n=6)Fig.5 Curves of LMG in Cyprinus carpio stored at -12 ℃(a) and -20 ℃(b)(n=6)

由圖5可知，新鮮的鯉基質(zhì)(B-0 M)、冷凍貯存1個月的鯉基質(zhì)(B-1 M)和冷凍貯存3個月的鯉基質(zhì)(B-3 M)，在-12 ℃和-20 ℃條件下保存40 h，LMG的回收率均在90.0%～110.0%之間，說明冷凍保存對LMG測定結(jié)果影響較小，均能滿足方法準確度和精密度的要求。隨著冷凍保存時間的延長，鯉基質(zhì)中LMG回收率僅出現(xiàn)了較小程度的下降趨勢，冷凍貯存3個月的鯉基質(zhì)(B-3 M)添加LMG標準溶液后在-12 ℃下保存40 h，回收率僅下降6.3%。與鰱基質(zhì)類似，-12 ℃較-20 ℃保存時下降速率更快，但冷凍貯存3個月的鯉基質(zhì)(B-3 M)，對LMG測定結(jié)果的影響較小，在不同冷凍保存條件下均能滿足方法準確度和精密度的要求。

以上結(jié)果表明，新鮮鰱基質(zhì)(A-0 M)和新鮮鯉基質(zhì)(B-0 M)中添加LMG標準液后，置于4種不同保存條件(22～23 ℃室溫、2～6 ℃冷藏、-12 ℃和-20 ℃冷凍保存)下的穩(wěn)定性均較好。隨著加標基質(zhì)貯存時間的延長，鰱基質(zhì)中的LMG添加回收率在室溫、冷凍和冷藏條件下均出現(xiàn)較大程度的下降，而鯉基質(zhì)中的LMG添加回收率在上述保存條件下下降程度遠低于鰱基質(zhì)。下降規(guī)律均為室溫條件下LMG添加回收率下降最快，-20 ℃時相對最慢，即溫度越高，下降速率越快。因此，基質(zhì)品種及空白基質(zhì)貯存時間是影響LMG測定結(jié)果的關(guān)鍵因素，加標后樣品的保存溫度和時間也會對LMG的測定結(jié)果產(chǎn)生影響。同一種魚糜基質(zhì)，空白基質(zhì)貯存時間越長，加標后保存溫度越高，保存時間越長，回收率越低。

2.3 稱樣與加標間隔時間對測定結(jié)果的影響

結(jié)合2.1和2.2的實驗結(jié)果可知，鰱基質(zhì)貯存時間對LMG測定結(jié)果有重要影響。為進一步考察空白基質(zhì)樣品稱取與加標間隔時間對LMG測定結(jié)果的影響，選取新鮮的鰱基質(zhì)(A-0 M)和冷凍貯存3個月的鰱基質(zhì)(A-3 M)，分別將基質(zhì)樣品稱取后保存0～5 d，再模擬能力驗證樣品制備方式處理樣品。稱樣與加標間隔時間對LMG測定結(jié)果的影響見圖6。

由圖6可知，對于新鮮的鰱基質(zhì)(A-0 M)，基質(zhì)樣品稱取與加標間隔時間為0～5 d時，LMG的回收率均在90.0～110.0%之間，而冷凍貯存3個月的鰱基質(zhì)(A-3 M)，LMG的回收率在40.9%～42.4%之間。由此可知，基質(zhì)樣品稱取與加標間隔時間對LMG測定結(jié)果無明顯影響，但鰱基質(zhì)貯存時間對LMG測定結(jié)果有重要影響。

圖6 稱樣和加標間隔時間對鰱基質(zhì)中LMG測定結(jié)果的影響(n=6)Fig. 6 The influence of time from weighing sample to standard addition on LMG content in Hypophalmichthys molitrix(n=6)

3 結(jié)論

基質(zhì)品種和空白基質(zhì)貯存時間是影響LMG測定結(jié)果的重要因素，冷凍貯存5個月的鯉基質(zhì)(B-5 M)對LMG的檢測結(jié)果影響較小，而冷凍貯存2個月的鰱基質(zhì)(A-2 M)，LMG添加回收率降低近30%。新鮮的鰱和鯉基質(zhì)(A-0 M和B-0 M)對LMG檢測結(jié)果影響較小，空白基質(zhì)貯存時間越長，基質(zhì)加標后的保存溫度越高、保存時間越長，LMG的回收率越低。稱樣與加標間隔時間對LMG的回收率無顯著影響。在開展水產(chǎn)品中MG殘留量檢測的能力驗證或?qū)嶒炇疫M行質(zhì)量控制時，應(yīng)盡可能選擇新鮮的基質(zhì)樣品，并盡快進行檢測，如果樣品不能及時檢測，則需盡快冷凍保存，盡可能保持樣品的原有屬性。本研究可為相關(guān)部門實施城市水產(chǎn)品例行監(jiān)測、產(chǎn)地監(jiān)督抽查、苗種監(jiān)督檢測及以添加方式開展能力驗證和數(shù)據(jù)比對提供借鑒和參考。