周旭峰 李江華 張愛華 魏曉麗 范宗憲 王桂梅 孫海燕

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages,TAM）是血液循環(huán)中的單核細(xì)胞受腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子和趨化因子作用，進(jìn)人腫瘤微環(huán)境后分化而成的成熟巨噬細(xì)胞，是浸潤在腫瘤組織周圍最多的免疫細(xì)胞，它可以分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[1，2]。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)TAM及微淋巴管在喉咽癌組織的表達(dá)情況，從而探討TAM浸潤在喉咽癌侵襲和發(fā)展中的作用及其與腫瘤預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

1 一般資料

隨機(jī)抽取2004年1月～2013年12月間，在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科接受手術(shù)的喉咽癌52例。其中男47例，女5例，年齡43～79歲，平均57歲。所有病例術(shù)前未行放化療，標(biāo)本經(jīng)病理確診，其中T1期4例、T2期15例、T3期10例、T4期23 例；高、中、低分化病例分別為 9、30、13 例；其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 21 例（N1、N2、N3分別為 7、13、1 例），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移9例。

2 主要免疫試劑及方法

DAB顯色試劑盒、PV-6000免疫組化試劑盒、CD68兔抗人單克隆抗體等主要試劑購自福建邁新生物科技公司。標(biāo)本石蠟包埋，做4um連續(xù)切片，免疫組化操作程序嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行，以PBS液代替一抗做陰性對(duì)照。

3 計(jì)數(shù)方法

CD68陽性表達(dá)位于巨噬細(xì)胞胞漿，呈黃褐色顆粒。每張免疫組化切片分別選取癌內(nèi)及癌周不同組織CD68+TAM最為密集的5個(gè)視野，在400倍顯微鏡下進(jìn)行CD68+TAM計(jì)數(shù)，根據(jù)CD68+TAM的中位數(shù)將標(biāo)本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組[3]。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，行方差齊性檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析，應(yīng)用Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析和Log-rank法檢驗(yàn)組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 喉咽癌組織CD68+TAM表達(dá)

喉咽癌組織CD68+TAM主要分布于癌內(nèi)及癌周間質(zhì)，呈片狀分布，胞體較大，形狀不規(guī)則。52例喉咽癌標(biāo)本中37例（71.51%）癌內(nèi)存在CD68+TAM浸潤，41例癌周存在CD68+TAM浸潤，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，癌內(nèi)CD68+TAMs數(shù)目為0至331之間(中位數(shù)為11.5個(gè))，癌周間質(zhì)CD68+TAM數(shù)目從0至347個(gè)（中位數(shù)為20.5個(gè)）。

癌旁正常組織CD68+TAM呈散在分布，數(shù)目從0至7個(gè)(中位數(shù)為2.5個(gè))。

2 癌內(nèi)及癌周間質(zhì)與癌旁正常組織CD68+TAM比較

癌內(nèi)與癌旁正常組織CD68+TAM計(jì)數(shù)有明顯差異（t=19.63，P<0.01），癌周間質(zhì)與癌旁正常組織CD68+TAM 計(jì)數(shù)有明顯差異（t=20.17，P<0.01），癌內(nèi)及癌周間質(zhì)CD68+TAM計(jì)數(shù)無明顯差異（t=2.19，P＞0.05）。

3 癌內(nèi)及癌周CD68+TAM計(jì)數(shù)與患者生存時(shí)間的關(guān)系

隨著喉咽癌組織癌內(nèi)CD68+TAM計(jì)數(shù)上升，患者生存時(shí)間變短，二者之間呈負(fù)相關(guān)，（r=-0.257，P<0.05）；同樣隨著癌周間質(zhì)CD68+TAM計(jì)數(shù)上升，患者生存時(shí)間變短，二者亦呈負(fù)相關(guān)（r=-0.269，P<0.05)。

4 癌內(nèi)及癌周間質(zhì)CD68+TAM浸潤與喉咽癌臨床指標(biāo)的關(guān)系

癌內(nèi)及癌周間質(zhì)CD68+TAM浸潤與臨床指標(biāo)的關(guān)系見表1。喉咽癌癌內(nèi)TAM計(jì)數(shù)隨腫瘤T分期上升而增加，并與腫瘤不良預(yù)后密切相關(guān)（P<0.05），而癌周間質(zhì)TAM計(jì)數(shù)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。

表1 癌內(nèi)及癌周CD68+TAM與喉咽癌臨床指標(biāo)的關(guān)系

5 CD68+TAM計(jì)數(shù)與喉咽癌預(yù)后的關(guān)系

本組52例病例5年內(nèi)死亡32例，均為腫瘤原因死亡，總體5年生存率為38.4%。根據(jù)CD68+TAM的中位數(shù)將病例分為癌內(nèi)高CD68+TAM組和低CD68+TAM組，癌周高CD68+TAM組和低CD68+TAM組，并繪制生存率曲線圖。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)組

圖1 癌內(nèi)高TAM組與低TAM組的生存曲線

討論

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)來源于血液循環(huán)中的單核細(xì)胞，主要分為兩種亞型，即M1型（經(jīng)典激活的TAM）和M2型（選擇性激活的TAM）。血液中的單核細(xì)胞受腫瘤和腫瘤間質(zhì)中細(xì)胞因子和趨化因子（CCL4,CCL5,CCL7,CCL8,CXCLI2,M-CSF,VEGF,PDGF等)的作用，被募集到腫瘤周圍，在各種細(xì)胞因子（如MCP-1，M-CSF,VEGF等）的刺激下，分化成為不同亞型的TAM[2]。輔助性1型T細(xì)胞因子IFN-γ，脂多糖（LPS），集落刺激因子（GM-CSF）等促使TAM向M1型極化；輔助性1型T細(xì)胞分泌和腫瘤來源的細(xì)胞因子：TGF-β、PGE2、IL-4、IL-13 等促使TAM向M2型極化[4]。在腫瘤微環(huán)境中M1型和M2型TAM可相互極化，Herwig[5]等研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ可誘導(dǎo)M1型TAM向M2型極化，M2型TAM比例的增高提示腫瘤細(xì)胞增殖及預(yù)后不良?，F(xiàn)有研究表明，TAM與肺癌、乳腺癌和胰腺癌等多種腫瘤患者不良預(yù)后密切相關(guān)[6，7]。本研究中，喉咽癌癌內(nèi)TAM浸潤密度隨著腫瘤T分期上升而增加，并且TAM浸潤密度越高，患者預(yù)后越差，表明TAM浸潤可促進(jìn)喉咽癌發(fā)展，與其預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。

圖2 癌周高TAM組與低TAM組的生存曲線

TAM參與并促進(jìn)腫瘤組織血管和淋巴管的生成。TAM能分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、尿激酶型纖溶酶原激活因子（uPA），MMPs和uPA可直接激活腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，促進(jìn)它們?cè)谀[瘤細(xì)胞間差異，癌內(nèi)高CD68+TAM組5年生存率為18.7%，癌內(nèi)低CD68+TAM組5年生存率為49.3%，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見圖1）；癌周間質(zhì)高CD68+TAM組5年生存率為19.3%，癌周間質(zhì)低CD68+TAM組5年生存率為51.7%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見圖 2）。外基質(zhì)中遷移，形成新的腫瘤血管[8]。Depalma等[9]研究表明，TAM通過ANG2/TIE2信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)性能，破壞原有血管以促進(jìn)血管生成。Riahov等[10]臨床研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、胃癌、乳腺癌、B細(xì)胞非Hodgkin淋巴瘤、膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中，TAM數(shù)量與腫瘤血管的密度等級(jí)呈正相關(guān)。Jeon等[11]通過對(duì)卵巢癌小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，TAM通過上調(diào)腫瘤組織中VEGF-C和VEGF-D表達(dá)來激活淋巴管特異性受體-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(VEGFR-3)，促進(jìn)淋巴管生成。Kurahara等[12]研究發(fā)現(xiàn)，TAM能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌VEGF-C促進(jìn)腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤，同時(shí)促進(jìn)腫瘤淋巴管的形成。在宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌組織中，TAM上調(diào)VECF-C表達(dá)，促進(jìn)腫瘤淋巴管的形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞淋巴管轉(zhuǎn)移[13，14]。本研究中，喉咽癌癌周間質(zhì)TAM浸潤與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此推測(cè)TAM可能通過促進(jìn)喉咽癌組織微淋巴管的生成而促使腫瘤通過淋巴管轉(zhuǎn)移，這與前述研究結(jié)果相符。

本研究表明，喉咽癌癌內(nèi)及癌周高TAM浸潤組患者5年生存率明顯低于癌內(nèi)及癌周低TAM組，可以推測(cè)TAM浸潤是影響喉咽癌患者預(yù)后的主要因素之一，我們可以通過檢測(cè)喉咽癌組織TAM浸潤情況，判斷喉咽癌患者的預(yù)后，為其臨床治療提供參考。