曲汝鵬 冷輝 孫海波

慢性扁桃體炎（Chronic tonsillitis，CT）是耳鼻咽喉科臨床常見的多發(fā)病，是由鏈球菌或葡萄球菌感染引起，或某些急性傳染性疾病反復發(fā)作或隱窩引流不暢，而致扁桃體隱窩及其實質發(fā)生的慢性炎癥病變。以咽喉腫痛、發(fā)熱、扁桃體紅腫、化膿等為主要表現(xiàn)的慢性炎癥性疾病[1]。截止目前國內外對于本病的研究仍未能闡明其發(fā)生機制，近年來研究認為IL-4介導的免疫應答在慢性扁桃體炎的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[2-5]。免疫球蛋白IgE是引起I型變態(tài)反應發(fā)生的主要抗體，健康人群的血清中IgE的含量極低，扁桃體中也無IgE表達。現(xiàn)有研究顯示，慢性扁桃體炎患者中，扁桃體組織表現(xiàn)為IgE和嗜酸細胞的浸潤，隱窩中網(wǎng)狀上皮及濾泡間區(qū)中含有大量的IL-4[2-5]，說明在慢性扁桃體炎患者存在一定的變態(tài)反應，推測可能為IL-4活化扁桃體中B淋巴細胞合成IgE[6]激發(fā)的變態(tài)反應有相關聯(lián)系。

中醫(yī)烙法作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學外治法的特色療法之一，不僅可保留扁桃體的體液免疫和細胞免疫功能，還可明顯提高了免疫球蛋白表達水平，進一步提高了患者的機體免疫力[7，8]。

本研究在以往研究基礎上，深入對細胞因子在扁桃體組織中的表達變化進行研究，探討細胞因子導致扁桃體致炎機理，并通過中醫(yī)烙法對目標指標表達的干預，推測中醫(yī)烙法的作用機制為抑制細胞因子表達實現(xiàn)消除慢性炎癥，提高患者的免疫力。

資料與方法

1 臨床資料

1.1 一般資料

本研究選取2017年5～10月期間在遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科門診慢性扁桃體炎患者10例及住院因特發(fā)性扁桃體肥大接受手術治療的患者10例為研究對象。兩組性別、年齡、扁桃體大小等方面比較,經(jīng)統(tǒng)計學處理,差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，且入組前2周內無全身或局部炎癥，未應用任何抗生素。本次研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準并獲得患者家屬的知情同意，選擇能配合完成治療，依從性高的患者。見表1。

表1 兩組一般資料均衡性比較（±s）

表1 兩組一般資料均衡性比較（±s）

組別 例 性別 年齡（歲） 扁桃體大小男女烙治組 1 0 6 4 8.6±2.1 1 Ⅱ°對照組 1 0 5 5 6.3±1.4 9 Ⅱ°

1.2 慢性扁桃體炎診斷和納入標準

符合慢性扁桃體炎診斷標準[9]；年齡4～20歲；病程1年以上，急性扁桃體炎每年發(fā)作4～5次；查體見雙扁桃體Ⅱ°肥大，表面不光滑，雙側腭咽弓血管走形明顯，呈暗紅色，用力擠壓腭舌弓，可從扁桃體隱窩口內溢出膿栓；本次只給予中醫(yī)烙法治療，未采用其他治療方法的患者。

1.3 慢性扁桃體炎排除標準

慢性扁桃體炎急性發(fā)作期患者；繼發(fā)引起腎小球腎炎、風濕性關節(jié)炎、長期低熱、心肌炎等患者；嚴重心、肝、腎、造血系統(tǒng)疾病和精神病者；不同意單純中醫(yī)烙法治療的患者。

1.4 對照組納入標準

同期選擇住院接受扁桃體切除的特發(fā)性扁桃體肥大（Idiopathic Tonsillar Hypertrophy ITH）患者。選擇標準為患者扁桃體體積增大引起阻塞性睡眠呼吸暫停，既往無扁桃體感染史，查體見雙側扁桃體光滑，腭舌弓淡紅，隱窩口形態(tài)正常。

2 方法

2.1 設備及試劑

2.1.1 中醫(yī)烙法器械

烙鐵 [所采用的烙鐵為我院自行研制的平板圓形中號烙鐵（直徑 7mm，厚度 2～3mm）]3～4支，壓舌板，酒精燈，麻油，頭燈。

2.1.2 試劑

IL-4（貨號：SEA077Hu）、IL-5（貨號：SEA 078 Hu）、IL-10（貨號：SEA056Hu）、IFN-γ（貨號：SEA 049Hu）、TGF-β（貨號：SEA124Hu） 含量檢測試劑盒，購自武漢優(yōu)爾生生物科技股份有限公司。

2.1.3 主要儀器

BS223S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)；酶標儀，奧地利安圖公司生產(chǎn)；電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特生產(chǎn)；SANYO超低溫冰箱，日本SANYO公司生產(chǎn)。

2.2 取材方法

2.2.1 CT患者

2.2.1.1 治療前取材

患者未進行中醫(yī)烙法治療前，1%利多卡因局麻下鉗取部分扁桃體上極組織，迅速放入液氮中冷凍，于-80℃冰箱內保存?zhèn)溆?。作為治療前樣本?/p>

2.2.1.2 中醫(yī)烙法治療

醫(yī)生與患者面對面端坐，先將烙鐵在酒精燈外焰燒至通紅（約120℃），取一支烙鐵蘸上麻油（約0.5s），趁著在麻油瓶中冒煙時取出烙鐵，與壓舌板同時迅速地送進口腔到咽部，對準扁桃體施行燒烙，燒烙瞬間當聽到局部發(fā)出“茲拉”聲音后（約0.5～1s）立即將烙鐵抽出，不宜停留。此為“一鐵”治療量。更換烙鐵，同法反復燒烙。將扁桃體表面烙成一片黑褐色烙痂為宜，一次治療量約每側扁桃體燒烙10～15“鐵”。一次治療結束后，每間隔2日再次行中醫(yī)烙法治療，共計烙治5次，完成中醫(yī)烙法治療。

2.2.1.3 治療后取材

患者完成所有中醫(yī)烙法治療后，以同樣方法鉗取部分扁桃體上極組織作為治療后樣本。

2.2.2 ITH患者

患者均于全麻下行雙側腭扁桃體切除術，生理鹽水漂洗清潔后，切除部分扁桃體上極組織作為對照組樣本，處理方式同CT患者標本組織。

2.3 分組

2.3.1 對照組

取材于ITH患者的扁桃體組織作為對照組。

2.3.2 烙治組

取材于CT患者的扁桃體組織作為實驗組，其中取材于首次中醫(yī)烙法治療前的扁桃體組織作為烙治前；取材于末次中醫(yī)烙法治療后的扁桃體組織作為烙治后。

2.4 指標檢測

使用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測各組扁桃體組織中 IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TGF-β 含量，步驟如下：

①取新鮮扁桃體組織100mg，剪碎放入2ml離心管中，加入預冷的，含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液1ml，高速勻漿機制備組織勻漿液，2000轉/分，離心10分鐘，取上清液，檢測細胞因子濃度。

②將試劑盒從冰箱中取出，在室溫環(huán)境中平衡1小時，達到室溫后繼續(xù)進行相關檢測。

③取出標準品，自備離心管7支，分別編號1～7，于1號管以外的6支離心管中均加入100ul標準品稀釋液，然后將標準品200ul加入1號管，按照倍比稀釋的方法，對標準品原液進行稀釋。即從1號管中吸取100ul液體，加入2號管，充分吹打后，從2號管中吸取100ul液體，加入3號管，充分吹打后，從3號管中吸取100ul液體，加入4號管，直至稀釋到7號管。

④在酶標板中設定標準孔，樣品孔和空白孔，按照預先設定的孔加入相應試劑或樣品。標準品孔加入上步驟中稀釋的1～7號標準品，50ul/孔。樣品孔加入各組細胞培養(yǎng)上清液，50ul/孔?？瞻卓撞患尤肴魏卧噭?。加樣完畢，將酶標板在水平桌面輕輕震蕩30秒，封板膜封板后，37℃恒溫水浴振蕩器中孵育2小時。

⑤取出酶標板，揭掉封板膜，棄掉板孔中液體，并于濾紙上拍干，每孔中加入洗滌液250ul，輕輕震蕩后，浸泡1分鐘后倒掉洗滌液，并再次于濾紙上拍干，如此反復3次。

⑥除空白孔外，其余各孔均加入酶標試劑，50ul/孔，輕輕震蕩后，封板膜封板，37℃恒溫水浴振蕩器中孵育1小時。

⑦取出酶標板，揭掉封板膜，棄掉板孔中液體，并于濾紙上拍干，每孔中加入洗滌液250ul，輕輕震蕩后，浸泡1分鐘后倒掉洗滌液，并再次于濾紙上拍干，如此反復3次。

⑧所有板孔均加入顯色液A和顯色液B，A、B均為50ul/孔，輕輕震蕩后，封板膜封板，37℃恒溫水浴振蕩器中孵育15分鐘。

⑨取出酶標板，切勿倒掉板孔中液體，直接向各孔中加入50ul終止液，輕輕震蕩30秒，于酶標儀中讀取各孔吸光度值。

⑩按照標準品孔OD值和相應濃度繪制標準曲線，擬合標準方程，將樣品孔OD值代入方程，計算樣品孔中細胞因子濃度，并進行統(tǒng)計分析。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件處理。整理、核對數(shù)據(jù)，所得實驗計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，首先檢查方差的齊性檢驗，然后采用完全隨機設計方差分析(One-way ANOVA法)，組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 扁桃體組織IFN-γ、TGF-β含量測定

扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量檢測結果顯示：與對照組（ITH患者）比較，實驗組（CT患者）扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與烙前比較，烙后扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2，見圖 1。

表2 各組扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量（±s）

表2 各組扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量（±s）

注：*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較；△P＜0.05，△△P＜0.01，與烙前組比較。

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圖1 各組扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量水平柱狀圖

圖1 ELISA法檢測IFN-γ、TGF-β含量標準曲線

2 扁桃體組織IL-4、IL-5、IL-10含量測定

扁桃體組織中IL-4、IL-5、IL-10含量檢測結果顯示：與對照組（ITH患者）比較，烙前組（CT患者）扁桃體組織中IL-4、IL-5、IL-10含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與烙前組比較，烙后組扁桃體組織中IL-4、IL-5、IL-10含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表3，圖 2。

表3 各組扁桃體組織中 IL-4、IL-5、IL-10 含量（±s）

表3 各組扁桃體組織中 IL-4、IL-5、IL-10 含量（±s）

注：*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較；△P＜0.05，△△P＜0.01，與烙前組比較。

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圖2 各組扁桃體組織中IL-4、IL-5、IL-10含量水平柱狀圖

圖2 ELISA法檢測IL-4、IL-5、IL-10含量標準曲線

討論

1 免疫因素對慢性扁桃體炎發(fā)病機制的影響。

慢性扁桃體炎是耳鼻咽喉科臨床常見的多發(fā)疾病，多由扁桃體急性炎癥反復刺激或因扁桃體隱窩內細菌等抗原物質寄存，引流不通暢，而致扁桃體隱窩及其實質發(fā)生慢性炎癥病變。還可以繼發(fā)于周邊器官和全身感染之后。截止目前國內外對于本病的研究仍未能闡明其發(fā)生機制，感染致病因素已達成共識，近年來研究認為本病與自身免疫反應有一定相關性。

腭扁桃體是人體機體免疫防御的重要免疫器官之一，位于上呼吸道的“咽喉要道”，是抵御呼吸道感染的第一道防線[10]。此防線依靠扁桃體通過免疫反應產(chǎn)生抗體的基本功能來實現(xiàn)的。再者，咽部淋巴組織豐富構成咽淋巴環(huán)結構，以腭扁桃體為主要代表發(fā)揮免疫功能。

慢性扁桃體炎患者扁桃體細胞免疫功能受到一定的抑制導致免疫失衡，扁桃體抵抗致病菌的能力因此下降，致病菌侵入扁桃體實質后開始大量繁殖，產(chǎn)生大量毒素侵蝕破壞扁桃體的隱窩上皮組織，導致炎癥反應的發(fā)生。

IFN-γ主要由活化的Th細胞和NK細胞產(chǎn)生。其生物學功能主要是免疫調節(jié),誘導多種抗原提呈細胞表達MHC-I/II分子,活化單核、巨噬細胞并增強其溶菌活性及分泌IL-1,6,8,TNF-a等，介導炎癥反應。

TGF-β可由機體多種細胞分泌，一般處于非活性狀態(tài)。在體外，非活性狀態(tài)的TGF-β又稱為latency associated peptide（LAP），通過酸處理后被活化。在體內，酸性環(huán)境一般存在于骨折附近和正在愈合的傷口。蛋白質的裂解作用可使TGF-β復合體變?yōu)榛罨腡GF-β。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調節(jié)作用。張蕊等[11]的研究表明，SPF雛雞感染IBDV后,其哈德爾腺和盲腸扁桃體中TGF-β1 mRNA表達水平顯著升高。提示TGF-β參與了該炎癥反應過程。

IL-4主要由活化的T細胞產(chǎn)生。其生物學作用為促使抗原或絲裂原活化的B細胞分裂增殖；促進T細胞的活性；IL-4不能刺激巨噬細胞增殖，但可增強巨噬細胞的功能；IL-4與IL-3協(xié)同可維持和促進肥大細胞的增殖，在某些超敏反應性疾病發(fā)生中具有一定的意義。有報道顯示，IL-4在慢性扁桃體炎的免疫應答過程中發(fā)揮重要的免疫促進或免疫抑制作用,影響慢性扁桃體炎炎癥反應的發(fā)生發(fā)展[12]。

IL-5由抗原活化的CD4+T細胞產(chǎn)生；肥大細胞也能產(chǎn)生IL-5。其主要功能是參與炎癥反應，刺激嗜酸性粒細胞增殖、分化及活化。IL-5不僅使嗜酸性粒細胞的數(shù)量增加，而且能增強其功能。在蠕蟲感染和過敏性疾病時出現(xiàn)的嗜酸性粒細胞增多主要是由IL-5引起的。人類IL-5還能促進嗜堿性粒細胞釋放組胺和白三烯等[13]炎癥介質，從而提高嗜堿性粒細胞的活性。楊珍的研究表明，慢性扁桃體炎的扁桃體組織中IL-4和IL-5均高表達,且主要分布于扁桃體的免疫功能區(qū),從而證明變態(tài)反應的存在為扁桃體反復發(fā)炎的病因之一。

IL-10是一種多細胞源、多功能的細胞因子。幾乎所有淋巴細胞均能合成IL-10。生物學功能主要是調節(jié)細胞的生長與分化，參與炎性反應和免疫反應，是目前公認的炎癥與免疫抑制因子。在腫瘤、感染、器官移植、造血系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，免疫功能失調和感染二者在慢性扁桃體炎發(fā)病中相互作用，感染可引起免疫功能下降，進而又是出現(xiàn)反復感染的原因之一。因此，我們認為，慢性扁桃體炎患者扁桃體組織中高表達的IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-5、IL-10 是慢性扁桃體炎癥反復發(fā)作原因之一。

2 中醫(yī)烙法對慢性扁桃體炎 IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-5、IL-10細胞因子的影響

中醫(yī)烙法治療慢性扁桃體炎的記載，最早可追溯到唐代孫思邈的《千金翼方》；明代陳實功的《外科正宗》明確地記載了應用“針烙”的方法治療乳蛾；清代《咽喉經(jīng)驗秘傳》中有烙法治療乳蛾的記載；清代金德鑒《焦氏喉科枕秘》中具體記載了烙鐵的質地、形狀及施烙方法、注意事項。近年來，隨著免疫研究的不斷深入，對于過早切除扁桃體組織存在爭議[14]。眾所周知，扁桃體為咽喉部最大的淋巴組織，擔負著上下呼吸道的防御功能，能夠產(chǎn)生免疫功能很強的免疫球蛋白IgA，抑制細菌對呼吸道黏膜的粘附，抑制細菌的生長和擴散。報道顯示，扁桃體摘除術后，機體出現(xiàn)呼吸道抗感染功能下降，免疫監(jiān)視功能障礙等成為大概率事件。而中醫(yī)烙法的發(fā)揚光大，使得慢性扁桃體炎的治療實現(xiàn)了“兩全”，既解決炎癥的反復發(fā)作，又保留了扁桃體。隨著科學技術的革新，本科室在孫海波教授、冷輝教授的不斷深入研究下，簡化了中醫(yī)烙法的操作流程，規(guī)范烙具，避免副反應發(fā)生，形成簡單易行、便于臨床推廣的治療規(guī)范[15]。課題組多年來的臨床實踐表明[16-21]，中醫(yī)烙法通過燒烙刺激后，患者血清IgG、IgA、IgM濃度較烙治前明顯升高，且接近正常人水平，說明殘留扁桃體仍可發(fā)揮其體液免疫作用，中醫(yī)烙法可保留扁桃體的免疫功能；中醫(yī)烙法提高了扁桃體的hBD-2的表達水平，且可能維持相當長的一段時間，從而達到治療的目的。中醫(yī)烙法對于慢性扁桃體炎臨床有效率達94.55%，一年復發(fā)率僅為3.03%[15，20]。多年的臨床應用和療效觀察告訴我們，中醫(yī)烙法不但可以保存扁桃體組織，消除慢性炎癥和臨床癥狀，還可提升患者的機體免疫能力，許多無法手術的患者也可得到中醫(yī)烙法治療。

我們前期研究[7，8]從烙治后免疫學和組織學觀察，證實中醫(yī)烙法對機體免疫力和扁桃體組織學的影響。本次實驗結果顯示：通過烙前組與對照組的IFN-γ、TGF-β比較發(fā)現(xiàn)，CT患者扁桃體組織中的IFN-γ、TGF-β含量顯著高于對照組，提示CT發(fā)生時，扁桃體局部發(fā)生炎癥反應，以IFN-γ、TGF-β高表達為主要表現(xiàn)。通過中醫(yī)烙法治療，烙后組患者扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量均顯著下降，說明中醫(yī)烙法對IFN-γ、TGF-β具有抑制作用，而中醫(yī)烙法的抗炎作用可能就是通過抑制IFN-γ、TGF-β的分泌實現(xiàn)的；通過對照組與烙前組IL-4、IL-5、IL-10含量比較，CT患者扁桃體組織中的IL-4、IL-5、IL-10 含量顯著高于對照組，提示 IL-4、IL-5、IL-10的高表達是慢性扁桃體炎炎癥反應的發(fā)生之一。與烙前組比較，烙后組扁桃體組織中IL-4、IL-5、IL-10的含量均顯著降低，說明中醫(yī)烙法對IL-4、IL-5、IL-10的合成與分泌具有一定的抑制作用。

綜上所述，慢性扁桃體炎發(fā)生時，扁桃體組織局部 IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TGF-β 等細胞因子的高表達狀態(tài)是導致其局部炎癥反應發(fā)生的關鍵因素，介導了局部炎癥反應的發(fā)生；中醫(yī)烙法可能是由于“熱”刺激改變扁桃體局部微環(huán)境，抑制扁桃體局部組織中 IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TGF-β 的合成與分泌，從而對慢性扁桃體炎產(chǎn)生抗炎作用。但中醫(yī)烙法通過何種途徑實現(xiàn)抑制IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TGF-β的合成與分泌尚需進一步研究。