董航， 嚴嬌， 謝銥子， 紀樹亮， 孫偉鵬， 孫治中， 李宗瑤

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院三骨科，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405）

骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）好發(fā)于中老年人，是由多種因素導致的一種全身骨代謝性疾病。骨質(zhì)疏松患者骨脆性增加，主要臨床癥狀為疼痛、身長縮短、駝背等。其最嚴重的并發(fā)癥是骨折，給患者帶來了沉重的經(jīng)濟負擔和身心的雙重痛苦[1]。有關(guān)資料顯示，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率已高居世界各種常見疾病中的第7位。隨著我國逐漸步入人口老齡化社會，骨質(zhì)疏松的治療日漸受到重視[2]。然而，許多臨床研究結(jié)果表明，臨床上常用的抗骨質(zhì)增生西藥均具有一定的不良反應，如長期使用激素治療的患者，其罹患乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、冠心病等疾病的幾率將有不同程度的升高[3，4]。骨質(zhì)疏松的臨床癥狀與中醫(yī)疾病“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”中的“不通則痛”、“腰脊不舉”、“兩足軟弱”、“不任其身”等表現(xiàn)相符。中醫(yī)以“骨痿”、“骨痹”或“骨枯”論治骨質(zhì)疏松，重溫補腎陽、強筋壯骨，兼以通經(jīng)活絡、祛風除濕、補氣養(yǎng)血[5]。其注重整體調(diào)理，且毒副作用小、簡便廉驗的優(yōu)勢，得到越來越多醫(yī)生和患者的認可，逐漸受到了關(guān)注[6，7]。

杜仲為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮。其味甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補肝腎、強筋骨、安胎的功效，主治腎虛腰痛、足膝痿弱?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》言其“主腰脊痛，補中，益精氣，堅筋骨”。有研究發(fā)現(xiàn)，杜仲能夠顯著提高大鼠血清鈣和雌二醇水平，同時降低骨鈣素及堿性磷酸酶的含量，從而治療大鼠去卵巢后引起的骨質(zhì)疏松，且鹽制杜仲的療效優(yōu)于生杜仲[8]。另外，杜仲的有效成分還具有減慢大鼠去勢引起的骨質(zhì)量下降及骨小梁減少，促進骨鈣素、骨保護素mRNA和護骨素蛋白表達的作用[9-11]。臨床研究表明，杜仲及其中成藥能顯著降低骨質(zhì)疏松患者血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、I型前膠原N端前肽（PINP）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）水平，上調(diào)血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平，改善骨質(zhì)疏松患者的骨代謝與骨密度情況[12，13]。當前對杜仲治療骨質(zhì)疏松作用機制的研究主要為動物實驗和臨床實驗，但仍不能整體、全面地反映杜仲作用機制網(wǎng)絡。

網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學的理論，對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡分析，選取特定信息節(jié)點進行多靶點藥物分子設計的新學科。其融合系統(tǒng)生物學、多向藥理學、生物信息學、計算機科學等多學科的技術(shù)和內(nèi)容，進行“疾病表型——基因——靶點——藥物”等多層次網(wǎng)絡的構(gòu)建，探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，指導新藥研發(fā)，闡明藥物作用機理。

杜仲治療骨質(zhì)疏松是多組分、多環(huán)節(jié)、多靶點綜合作用的結(jié)果，針對單一靶點進行研究，難免存在局限性。網(wǎng)絡藥理學整體性、系統(tǒng)性及復雜性的研究角度和研究方法，正與中醫(yī)藥特點相符合。遵循傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，應用多種現(xiàn)代醫(yī)學先進的理論和技術(shù)手段，深入探討杜仲防治骨質(zhì)疏松的機理，從整體上闡明其改善機體的調(diào)節(jié)作用機制，是中藥現(xiàn)代化發(fā)展的需要。因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法從整體角度對杜仲治療骨質(zhì)增生的作用機制進行探討，以期為深入研究杜仲及含有杜仲的中藥復方的抗骨質(zhì)疏松作用和臨床應用提供參考依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1藥物活性成分的獲取通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/，Version 2.3），以“杜仲”作為關(guān)鍵詞進行檢索，設置限定條件為口服利用度（OB）＞30%，類藥性（DL）＞0.18，獲取杜仲同時符合上述兩個條件的所有化學成分信息。利用Pubchem檢索出所有活性成分各自的3D結(jié)構(gòu)，保存為mol2格式。

1.2活性成分作用靶標及骨質(zhì)疏松作用靶標相應基因的獲取反向分子對接服務器（DRAR-CPI）是可以基于反向分子對接方法，對藥物活性成分與蛋白的作用強度進行打分的服務器[14]。將上述檢索所得的杜仲治療骨質(zhì)疏松的活性成分的mol2格式導入DRAR-CPI，按服務器所推薦，選取Z-score＜-0.5的蛋白作為杜仲活性成分的預測靶標。于UniProt數(shù)據(jù)庫中檢索“杜仲”蛋白靶標的蛋白數(shù)據(jù)庫（PDB）ID，限定物種為“Human”，從而得到相應的基因靶標。以“osteoporosis”或“OP”作為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫和在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數(shù)據(jù)庫中進行檢索，收集與骨質(zhì)疏松相關(guān)的靶標基因，并與上述檢索所得的杜仲的活性成分作用的靶標基因進行比對，以篩選出共同靶標。

1.3成分——靶標作用網(wǎng)絡構(gòu)建與分析將杜仲的活性成分與抗骨質(zhì)疏松作用靶標導入Cytoscape 3.6.0軟件，構(gòu)建其“成分——靶標”網(wǎng)絡。

1.4核心靶標相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建與分析在String數(shù)據(jù)庫中檢索杜仲治療骨質(zhì)疏松的潛在靶標獲取相互作用關(guān)系，將其導入Cytoscape 3.6.0軟件，繪制蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡，使用Cytoscape的Network Analyzer功能對其進行網(wǎng)絡分析，調(diào)節(jié)節(jié)點大小的顏色以反映Degree的大小，最終獲得蛋白相互作用網(wǎng)絡圖。

1.5分子對接Systems Dock Web Site分子對接服務器是基于DocK-IN評分的分子對接功能對蛋白質(zhì)——配體結(jié)合潛力進行評估[15]。篩選上述Degree值排名前5位的靶標，將其導入Systems Dock Web Site分子對接服務器中與杜仲的活性成分進行分子對接，并分析分子對接結(jié)果的Docking Score，用于對杜仲活性成分與核心靶標之間結(jié)合活性的評價。

1.6生物學過程與通路分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫對杜仲的作用靶標進行基因本體論（GO）分析與京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，得到通路富集結(jié)果，選取其中P＜0.001的通路，將富集基因數(shù)按降序排列，選取前20名的通路，利用OmicShare網(wǎng)站繪制通路信息圖。

1.7成分——靶標——通路網(wǎng)絡構(gòu)建通過分析排名前20的KEGG通路，結(jié)合文獻檢索，篩選出其中可能與治療骨質(zhì)疏松相關(guān)的通路，找出富集在上述通路上的杜仲抗骨質(zhì)疏松的潛在靶標，并與相應的活性成分相對應，最終構(gòu)建“成分——靶標——通路”多維網(wǎng)絡關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1杜仲活性成分分析在TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集杜仲的化學成分，以OB＞30%，DL＞0.18為篩選標準，得到具有抗骨質(zhì)疏松作用的活性成分28個，具體見表1。

2.2靶標預測在DRAR-CPI服務器中搜索杜仲28個活性成分對應的潛在靶標，共獲得386個，剔去重復靶標后獲得265個潛在靶標。在Uniprot數(shù)據(jù)庫中輸入潛在靶標的PDB ID，得到基因靶標123個。通過OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫中骨質(zhì)疏松相關(guān)基因的比對，篩選出可能有抗骨質(zhì)疏松作用的潛在靶標61個，具體見表2。

2.3成分——靶標網(wǎng)絡構(gòu)建在Cytoscape軟件中輸入活性成分與潛在靶標的相關(guān)數(shù)據(jù)，構(gòu)建杜仲的成分——靶標網(wǎng)絡，見圖1。圖中涉及節(jié)點80個，邊387條。不同的節(jié)點代表的意義不同，橙色六邊形節(jié)點表示活性成分，藍色圓形節(jié)點表示潛在靶標，邊表示活性成分與潛在靶標之間互相關(guān)聯(lián)。由成分——靶標網(wǎng)絡可知，杜仲治療骨質(zhì)疏松具有多成分、多靶標的特點，非單一成分、單一靶標作用而成。

2.4靶標相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建使用String數(shù)據(jù)庫獲取杜仲與骨質(zhì)疏松相關(guān)靶標的相互作用關(guān)系，導入Cytoscape軟件，構(gòu)建靶標相互作用網(wǎng)絡，見圖2。網(wǎng)絡中的節(jié)點代表蛋白靶標，邊代表蛋白靶標之間的相關(guān)性。蛋白靶標的Degree值大小通過節(jié)點顏色和大小來體現(xiàn)，節(jié)點越大、顏色越深說明Degree值越大。由圖2可知靶標相互作用網(wǎng)絡共涉及節(jié)點61個，邊453條。通過Degree值與現(xiàn)有研究結(jié)果推測杜仲抗骨質(zhì)疏松作用與甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、骨鈣素（bone Gla protein，BGP）、過氧化物酶增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related protein 2，RUNX2）有關(guān)。

2.5分子對接選取靶標相互作用網(wǎng)絡中Degree值靠前的5個靶標PTH、BGP、PPAR、ALP、RUNX2，通過Systems Dock Web Site軟件與杜仲的28個活性成分進行分子對接，結(jié)果Docking Score值＞7.0的有10個（7%），在7.0～5.0之間的有76個（54%），在4.25～5.0之間的有38個（27%），＜4.25的有16個（11%）。Docking Score值＞4.25表示分子和靶標具有一定的結(jié)合能力，＞5.0表示結(jié)合能力較高，＞7.0表示結(jié)合能力很高，見圖3。因此，分子對接驗證結(jié)果提示，杜仲的活性成分和靶標之間具有良好的結(jié)合能力。

表1 杜仲活性成分表Table 1 Active components of Cortex Eucommiae

2.6 GO和KEGG通路富集分析對杜仲活性成分的相應靶標進行GO和KEGG通路富集分析，以P＜0.05為閾值，篩選出靠前的通路與生物過程（見圖4～7）。GO富集分析包括細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）3部分。結(jié)果BP分析排名較前的為Wnt信號通路（Wnt signaling pathway），鈣調(diào)節(jié)通路（calcium modulating pathway）、蛋白激酶活性激活（activation of protein kinase activity）、流出道形態(tài)發(fā)生（outflow tract morphogenesis）、化學突觸傳導（chemical synaptic transmission）、凋亡程序正調(diào)控（positive regulation of apoptotic process），見圖4。MF分析排名較前的為Wnt激活受體活性（Wnt-activated receptor activity）、細胞因子活性（cytokine activity）、速激肽受體活性（tachykinin receptor activity）、蛋白異源二聚體活性（protein heterodimerization activity）、酶綁定（enzyme binding），見圖5。CC分析排名較前的為受體復合物（receptor complex）、神經(jīng)細胞體（neuronal cell body）、 側(cè) 漿 膜（lateral plasma membrane）、細胞皮層（cell cortex）、高爾基腔（Golgi lumen），見圖6。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示杜仲治療骨質(zhì)疏松的靶標主要與磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶Akt、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、叉頭框蛋白O（FoxO）信號通路及人嗜T淋巴細胞病毒I型（HTLV-I）感染等相關(guān)，見圖7。

表2 杜仲潛在靶標信息列表Table 2 The information of the candidate targets of Cortex Eucommiae

圖1 杜仲成分——靶標網(wǎng)絡Figure 1 The component-target network of Cortex Eucommiae

圖2 杜仲靶標相互作用網(wǎng)絡Figure 2 The candidate target interaction network of Cortex Eucommiae

圖3 分子對接圖Figure 3 The diagram for molecular docking

圖4 杜仲活性成分對應靶標的BP分析Figure 4 The analysis for biological processes of candidate targets of active components in Cortex Eucommiae

圖5 杜仲活性成分對應靶標的CC分析Figure 5 The analysis for cellular component of candidate targets of active components in Cortex Eucommiae

圖7 杜仲活性成分對應靶標的KEGG通路富集分析Figure 7 KEGG pathway enrichment analysis for candidate targets of active components in Cortex Eucommiae

2.7杜仲成分——靶標——通路網(wǎng)絡構(gòu)建依據(jù)現(xiàn)有研究成果篩選出可能具有抗骨質(zhì)疏松作用的通路，將其與杜仲的活性成分與潛在靶標一一對應，構(gòu)建成分——靶標——通路多維網(wǎng)絡，見圖8。由圖8分析可得，杜仲治療骨質(zhì)疏松涉及的活性成分共12個。這些活性成分作用的靶標包括PTH、BGP、PPAR、ALP、RUNX2等共35個，主要涉及PI3K-Akt、VEGF、AMPK、Notch、核因子kappa B（NF-κB）、FoxO、HTLV-I等7個信號通路。

3 討論

杜仲屬杜仲科植物，有補益肝腎、強筋壯骨、安胎元之效[16]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載其“主治腰膝痛，補中，益精氣，堅筋骨”。近年來許多動物實驗與體外實驗結(jié)果表明，杜仲通過提高雌激素水平、調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)細胞因子以及促進護骨素形成等發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，但其機理尚未明確[17]。因此，研究杜仲治療骨質(zhì)疏松的分子作用機制具有較大的意義。

本研究收集到杜仲中具有抗骨質(zhì)疏松作用的化學成分主要是槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、Mairin、olivil、Eucommin A、Cyclopamine、liriodendrin-qt、D6、D3、Helenalin、Yangambin、D1等。如杜仲中的槲皮素能使ERK磷酸化激活，促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖[18]。山柰酚能夠增加骨密度，使骨質(zhì)疏松的骨微結(jié)構(gòu)得到改善，其抗骨質(zhì)疏松作用強于槲皮素[19]。

圖8 杜仲“成分——靶標——通路”多維網(wǎng)絡關(guān)系圖Figure 8 The component-target-pathway network for Cortex Eucommiae

本研究發(fā)現(xiàn)，杜仲可能通過調(diào)節(jié)PTH、BGP、PPAR、ALP、RUNX2等靶標達到治療骨質(zhì)疏松的目的。如PTH可刺激骨形成、增大骨密度、改善骨質(zhì)疏松微結(jié)構(gòu)、逆轉(zhuǎn)骨退化，而PTH類藥物也已作為一種骨形成促進劑應用于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的預防治療[20]。BGP水平降低可影響骨代謝，加快骨吸收，進而對骨質(zhì)疏松的發(fā)生產(chǎn)生影響[21]。PPAR即過氧化物酶體增長因子活化受體，其亞型PPARγ2與配體可調(diào)節(jié)脂代謝來影響骨代謝平衡，減少成骨細胞，導致骨質(zhì)疏松[22]。骨ALP是骨形成中的一種主要功能酶，是骨形成、骨轉(zhuǎn)換的標志物[23]。RUNX2為Runt基因家族里的轉(zhuǎn)錄因子，它可調(diào)節(jié)破骨細胞、成骨細胞和基質(zhì)蛋白等的生理活動來影響骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展[24]。

本研究結(jié)果顯示，杜仲治療骨質(zhì)疏松的過程可 能 涉 及 PI3K-Akt、 VEGF、 AMPK、 Notch、NF-κB、FoxO、HTLV-I等信號通路。PI3K/Akt信號通路是機體細胞生長、增殖與抗凋亡的一個重要調(diào)節(jié)因素[25]，有研究認為它可能是成骨細胞與破骨細胞增殖、分化、凋亡調(diào)控的中心，能影響骨轉(zhuǎn)換的平衡[26]。VEGF是血管中的一種生長因子，可影響內(nèi)皮、血管和骨骼的合成與生長，還可影響骨骼構(gòu)成和骨骼替換[27]。AMPK是胞內(nèi)能量感受器、能量與代謝平衡調(diào)節(jié)器，它也可調(diào)節(jié)骨組織代謝。AMPK可能通過成骨分化、骨吸收與破骨細胞活化等生理活動的調(diào)節(jié)，影響骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展[28]。Notch信號通路主要參與了機體的生長發(fā)育和細胞分化[29]。此信號通路的減弱常和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性的骨髓間充質(zhì)干細胞增殖、分化能力減弱相關(guān)，可能是導致骨量降低的因素[30]。NF-κB是與多種炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，炎癥細胞因子通過促進破骨細胞的生成與分化，導致了骨的生成與吸收之間的平衡，使得骨質(zhì)減少加速，骨質(zhì)減少，最終出現(xiàn)骨質(zhì)增生或者骨折[31]。FoxO在骨代謝中通過減少成骨細胞中自由氧濃度提高抗氧化能力，同時可以促進成骨細胞分化，來預防骨質(zhì)疏松[32]。HTLV-I感染后患者有20%～30%發(fā)生高鈣血癥，甲狀旁腺相關(guān)蛋白（PTHrP）的產(chǎn)生是出現(xiàn)高鈣血癥的主要原因，由Tax反式激活PTHrP基因表達會促進骨質(zhì)的分解，造成骨質(zhì)疏松[33]。因此，杜仲可能通過PI3K-Akt、VEGF、AMPK、Notch、NF-κB、FoxO、HTLV-I等信號通路來調(diào)節(jié)骨細胞的各種生理活動，達到治療骨質(zhì)疏松的目的。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法分析杜仲治療骨質(zhì)疏松的有效化學成分和作用機制，通過相關(guān)網(wǎng)絡圖的構(gòu)建可直觀地顯示出杜仲治療骨質(zhì)疏松具有多成分，多層次，多途徑共同作用的特點，符合中醫(yī)藥治療疾病的特色，相比于西藥的單一作用機制，其優(yōu)勢明顯。分子對接模擬試驗結(jié)果顯示本次研究數(shù)據(jù)較為準確，具有較高的可信度。網(wǎng)絡藥理學分析結(jié)果也與現(xiàn)有研究結(jié)果基本一致。但利用網(wǎng)絡藥理學方法研究杜仲抗骨質(zhì)疏松的機制，僅是基于分子機制的預測，后期我們將在此研究結(jié)果的基礎上，借助學校動物實驗中心以及附屬醫(yī)院為平臺，開展進一步的動物實驗以及臨床試驗研究，以驗證其具體作用機制。