賴曉紅，梁 樺，劉洪珍，王漢兵，李露君

(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院麻醉科 528000)

胃癌是常見的惡性腫瘤，由胃癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)在惡性腫瘤中位居第二，僅次于肺癌，而大多數(shù)胃癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已處于胃癌晚期[1]。手術(shù)是胃癌最重要的治療方法之一。丙泊酚是胃癌根治術(shù)中常用的靜脈麻醉藥，而關(guān)于丙泊酚對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用結(jié)果不一致[2-4]。筆者前期研究表明丙泊酚可抑制體外培養(yǎng)的人胃癌MKN-45細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[5]，但具體機(jī)制不明。本研究擬探討丙泊酚抑制人胃癌MKN-45細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力與Fascin、HPA蛋白表達(dá)的相關(guān)性，為胃癌患者在麻醉期間用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑和儀器 胃癌MKN-45細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)研究所)，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司,美國)，丙泊酚(阿斯利康公司，批號(hào)NJ059，英國)，Transwell小室(Corning公司，美國)，Matrigel膠(BD公司，美國)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司，美國)，兔抗人Fascin蛋白多克隆抗體(CST公司，美國)，兔抗人HPA多克隆抗體、鼠抗人GAPDH抗體(Santa Cruz公司，美國)，倒置光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 準(zhǔn)備好含10 %的胎牛血清，且每毫升含100 U青霉素和100 U鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，將符合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的人胃癌MKN-45細(xì)胞放入培養(yǎng)基，并放入條件為37 ℃、含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4天用含0.02% 乙二胺四乙酸的0.25%胰蛋白酶溶液消化，以1∶3傳代培養(yǎng)。

1.3丙泊酚干預(yù) 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞分為5組，分別為加入4、8、16 μg/mL丙泊酚的P4、P8、P16組，不做干預(yù)的空白對(duì)照組(C組)和丙泊酚的溶劑脂肪乳組(I組)，以上處理時(shí)間均為24 h。

1.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力 在6孔板背后用標(biāo)記筆均勻地劃上橫線，每道橫線相隔5 mm，橫穿過孔，每孔5條線。每組取6個(gè)培養(yǎng)孔。各組細(xì)胞處理后換液，再用絲裂霉素處理1 h。用20 μL移液器槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線進(jìn)行細(xì)胞劃痕。洗滌3次后加入無血清培養(yǎng)基并拍照，此時(shí)的劃痕距離為T0，放入37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再拍照，此時(shí)的劃痕距離為T24。計(jì)算細(xì)胞遷移率=(T0-T24)/T0×100%。

1.5Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 于4 ℃溶解Matrigel膠24 h后，取40 μL，加入預(yù)冷的Transwell小室，上室和下室用孔徑為8 μm的聚碳酸酯微孔膜分隔，于37 ℃下聚合30 min以凝固Matrigel膠。吸走小室中多余的液體，在上室加100 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基、下室加入600 μL含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃下放置12 h后洗滌。消化各組MKN-45細(xì)胞，每組取6個(gè)復(fù)孔，用含0.2%牛血清清蛋白(BSA)的培養(yǎng)基重懸，收集細(xì)胞。以每室100 μL 的量分別加入上室， 于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出小室，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌1次，加入0.5%結(jié)晶紫染色10 min，后用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)下室的細(xì)胞數(shù)(即穿過濾膜的細(xì)胞數(shù))，隨機(jī)選取5個(gè)視野，取其平均值。

1.6Western blot法檢測(cè)人胃癌MKN-45細(xì)胞中Fascin、HPA蛋白的表達(dá) 胰酶消化收集各組細(xì)胞，離心10 min后棄培養(yǎng)液，用PBS清洗，再加入100 μL的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心5 min后，取上清液。BCA法進(jìn)行蛋白定量。取10 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，后沖洗凝膠，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液(含0.1% Tween 20)封閉，后分別加入1∶500稀釋的兔抗人Fascin多克隆抗體，1∶500稀釋的兔抗人HPA蛋白多克隆抗體，內(nèi)參為1∶1 000稀釋的鼠抗人GAPDH，于24 ℃下孵育4 h，用含0.1%Tween20的TBST洗膜3次，每次15 min，加入1∶2 000辣根過氧物酶體HRP標(biāo)記的二抗，24 ℃作用1 h，后用TBST避光洗膜3次，每次15 min，后放置暗盒中顯影。掃描PVDF膜，進(jìn)行吸光度(A)值分析，將Fascin和HPA的A值與GAPDH的A值對(duì)比，其比值反映Fascin和HPA蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

與C組比較，P4、P8、P16組細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力降低(P<0.05)，I組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨著丙泊酚濃度的增加，細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力逐漸降低(P<0.05)，見表1，圖1、2。與C組比較，P4、P8、P16組Fascin和HPA蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05),I組上述指標(biāo)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨著丙泊酚濃度的增加，F(xiàn)ascin和HPA蛋白的表達(dá)逐漸下調(diào)(P<0.05),見圖3、表2。

圖1 各組人胃癌MKN-45細(xì)胞的遷移能力檢測(cè)(×40)

A：C組；B：I組；C：P4組；D：P8組；E：P16組

圖2各組人胃癌MKN-45細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)(Transwell×200)

表1 各組細(xì)胞24 h遷移與侵襲能力

a：P<0.05，與C組比較；b：P<0.05，與P4組比較；c：P<0.05，與P8組比較

圖3 各組人胃癌MKN-45細(xì)胞Fascin和HPA蛋白Western blot圖

組別FascinHPAC組0.87±0.121.97±0.33I組0.98±0.112.08±0.28P4組0.49±0.13a1.49±0.27aP8組0.27±0.06ab1.01±0.14abP16組0.11±0.02abc0.53±0.16abc

a：P<0.05，與C組比較；b：P<0.05，與P4組比較；c：P<0.05，與P8組比較

3 討 論

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可模擬腫瘤細(xì)胞遷移的過程，在一定程度上是評(píng)價(jià)體外腫瘤細(xì)胞遷移能力的有效方法；Transwell實(shí)驗(yàn)中小室上、下室之間的基質(zhì)膠與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)相似，腫瘤細(xì)胞分解并穿過基質(zhì)膠的能力反映了細(xì)胞的侵襲能力[6-7]。本研究結(jié)果表明，丙泊酚可抑制體外培養(yǎng)的人胃癌MKN-45細(xì)胞的遷移和侵襲，且隨著丙泊酚濃度的增加，細(xì)胞的遷移和侵襲能力逐漸降低，這與筆者前期的研究結(jié)果一致[5]。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是癌癥患者死亡的重要原因。腫瘤細(xì)胞分泌蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜發(fā)生的侵襲過程，以及游離出細(xì)胞外基質(zhì)后發(fā)生的遷移過程，是轉(zhuǎn)移能否成功的兩個(gè)較為關(guān)鍵因素[8]。因此，抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲是防止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要手段[9]。Fascin蛋白是一種細(xì)胞骨架蛋白，在細(xì)胞遷移、黏附和細(xì)胞間相互作用中起重要作用，在正常上皮結(jié)構(gòu)中幾乎檢測(cè)不到，但在胃癌患者中高度表達(dá)。Fascin蛋白的過度表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)；在小鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，抑制Fascin蛋白的表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞遷移和體外侵襲，從而減少腫瘤的轉(zhuǎn)移[10-11]。HPA蛋白是一種內(nèi)-B-D-葡萄糖醛酸苷酶，具有切割細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸乙酰肝素的能力，而硫酸乙酰肝素則起著維持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定性的重要作用，同時(shí)HPA蛋白可重塑細(xì)胞基底膜的結(jié)構(gòu)，這有利于腫瘤細(xì)胞穿破細(xì)胞外基質(zhì)和血管壁，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。HPA蛋白在很多腫瘤患者中均高度表達(dá)，包括結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、宮頸癌、乳腺癌、胃癌和前列腺癌等[12-13]。本研究結(jié)果提示，經(jīng)丙泊酚處理后的人胃癌MKN-45細(xì)胞遷移和侵襲能力下降，并隨著丙泊酚濃度的增加，其遷移和侵襲能力逐漸下降，同時(shí)Fascin、HPA蛋白表達(dá)也逐漸下調(diào)，提示丙泊酚抑制人胃癌MKN-45細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用可能與其下調(diào)人胃癌MKN-45細(xì)胞中Fascin、HPA蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力有關(guān)。

綜上所述，丙泊酚可呈濃度依賴性地抑制人胃癌MKN-45細(xì)胞的遷移和侵襲，其機(jī)制可能與下調(diào)Fascin和HPA蛋白的表達(dá)有關(guān)。