馮 偉，王 瑜，張定林，李曉宇,3，孫鳳軍△

(1.陸軍軍醫(yī)大學西南醫(yī)院藥劑科,重慶 400038；2.陸軍軍軍醫(yī)大學基礎部化學教研室,重慶 400038；3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第980醫(yī)院邯鄲院區(qū)藥劑科,河北邯鄲 056001)

尿道導管主要用于手術期間收集尿液和測量ICU患者的尿量或長期用于治療輸尿管梗阻、尿滯留和尿失禁[1]。伴隨醫(yī)療技術的進步患者使用尿道導管的比例不斷增高，同時使用尿道導管導致的導管相關性尿路感染(catheter associated urinary tract infection,CAUTI)也越來越多，尤其是細菌生物膜感染。在ICU，超過39%的CAUTI是由銅綠假單胞菌和大腸埃希菌引起的[2-3]。而細菌一旦形成生物膜，即可逃避宿主免疫反應的攻擊和抗菌藥物的殺滅，而一旦條件合適，細菌生物膜就可發(fā)生播散，導致慢性感染或感染復發(fā)，給臨床治療帶來了極大困難[4-5]。

抗菌藥物通過全身性使用會導致耐藥菌和藥物不良反應的出現(xiàn)[6]。有文獻報道通過廣譜抗菌藥物涂抹生物材料來防止細菌的黏附、定植和生物膜形成[7]。對于短期尿道插管，已有呋喃西林或銀合金浸漬導管控制尿路感染的相關報道。β-內酰胺類抗菌藥物頭孢他啶(ceftazidime，CAZ)在體外可以顯著抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成[8]，然而關于體內研究目前尚無相關報道。因此，本研究以雌性C57BL/6系小鼠為動物模型，考察CAZ納米粒包被導管對銅綠假單胞菌引起的CAUTI的影響，為臨床治療CAUTI提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗菌株及動物來源 銅綠假單胞菌PAO1保存于陸軍軍醫(yī)大學西南醫(yī)院藥理基地。C57BL/6系雌性小鼠，6～8周齡，體質量20 g左右，來自陸軍軍醫(yī)大學動物中心。

1.2主要試劑及設備 CAZ(中國食品藥品檢定研究院)，MH瓊脂(英國Oxoid公司)，LB培養(yǎng)基(青島海博生物技術有限公司)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術有限公司)，聚乳酸-羥基乙酸共聚物 (PLGA，50∶50)、脫氧膽酸鈉(美國Sigma公司)，15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯 (HS15，德國BASF公司)，醫(yī)用級硅膠導管(型號SIL025，美國Braintree Scientific公司)，PE-10聚乙烯管(美國BD公司)，高效液相色譜儀(HPLC，美國Waters公司)，超聲波破碎儀(美國Sonics公司)。

1.3方法

1.3.1CAZ納米粒的制備及濃度測定 將20 mg PLGA溶于1 mL氯仿中，將2 mg CAZ、0.5%脫氧膽酸鈉和0.5% HS15溶于10 mL超純水中，將有機相加入水相中，探頭超聲攪拌10 min，功率45%，超聲間隔每次5 s，于旋轉蒸發(fā)儀上旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑，溶液由白色乳狀液變?yōu)閹в腥楣獾某吻迦芤杭吹肅AZ納米粒。采用HPLC測定CAZ在PLGA納米粒中的含量。取制備好的納米粒溶液100 μL，加入900 μL 乙腈溶液破乳，混合均勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾后進行HPLC分析。色譜條件：色譜柱為Diamonsil 反相C18柱(250.0 mm×4.6 mm×5.0 μm)，流動相為乙腈-含0.05 mol/L 磷酸二氫鉀緩沖鹽溶液(pH=2.5，體積比10.4∶89.6)，流速為1.2 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫30 ℃，進樣體積為20 μL。另取100 μL納米粒溶液稱質量，計算載藥量。納米粒載藥量=包裹在納米粒中的藥物含量/稱取的納米粒質量×100%。

1.3.2CAZ納米粒包被導管及表面藥物含量測定 將無菌的4～6 mm硅膠導管浸入載有CAZ的PLGA納米粒溶液中，浸泡1 h后取出，于37 ℃干燥過夜。為獲得均勻致密的涂層，重復此過程 3次。上述過程均在無菌層流條件下完成。之后將導管用去離子水沖洗后于室溫干燥至少2 h，備用。 取1 cm CAZ納米粒包被導管浸入含有2 mL乙腈的燒杯中，破乳使藥物釋放出來。將導管置于乙腈溶液中室溫放置24 h。之后將導管取出放入新鮮的乙腈溶液中，使藥物繼續(xù)釋放。重復該過程3次，確保藥物釋放完全。合并3次的藥物溶液，取1 mL過濾進行HPLC分析，測定藥物總量。

1.3.3CAZ納米粒包被導管的體外釋藥率 取 3 段1 cm CAZ納米粒包被導管分別置于含有20 mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)的離心管中，將離心管置于恒溫搖床中，每天自離心管中取出 4 mL 液體,共取7 d， 用HPLC測定溶液中CAZ含量，同時立即向離心管中補加4 mL同溫度的新鮮介質，由標準曲線計算溶液中CAZ的濃度及累計釋放率。取3份樣本的平均值繪制導管表面CAZ的累積釋放曲線圖。體外CAZ釋放率=釋放介質中 CAZ含量/導管上CAZ總量。

1.3.4CAZ納米粒包被導管的體外抑菌活性 挑取銅綠假單胞菌PAO1單菌落接種于LB肉湯中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。 用無菌生理鹽水稀釋菌液至0.5×108CFU/mL，然后用無菌棉簽蘸取菌液涂布在MH瓊脂平板上。使用無菌鑷子分別將1 cm不含有CAZ的導管和1 cm CAZ納米粒包被尿管輕輕放置在MH瓊脂板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。通過測量和記錄導管周圍的抑菌圈評估其抗菌活性。然后將導管取出并轉移至新鮮的MH瓊脂平板，確保導管的同一側與瓊脂接觸， 重復如此操作至第7天，記錄每天抑菌圈大小。

1.3.5小鼠CAUTI模型的建立 (1)菌液制備：將無菌導管放入24孔板中，銅綠假單胞菌PAO1過夜培養(yǎng)物用LB 稀釋1 000倍，然后取1 mL稀釋菌液加入24孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h。將導管表面的生物膜洗脫下來，稀釋至1×108CFU/mL用于體內試驗。(2)感染模型建立：4～6 mm長的硅膠導管安裝在6～8 mm長的PE-10聚乙烯管上，后者再連接到魯爾接頭適配器上。 整個裝配浸泡在70%乙醇中，空氣干燥后用紫外線消毒約2 h。每只小鼠尿道區(qū)域用75%乙醇擦拭，膀胱排空尿液。將帶有硅膠導管和PE-10聚乙烯管的適配器輕輕地插入小鼠的尿道口。PE-10聚乙烯管用鑷子輕輕推進。硅膠導管被釋放到膀胱中，小心取出帶有PE-10聚乙烯管的適配器，從而將硅膠管留在膀胱中。在膀胱內植入硅膠導管后，將50 μL PBS或銅綠假單胞菌PAO1菌液經(jīng)尿道導管接種到膀胱中。實驗分組：空白對照組，小鼠體內植入未包被的導管；CAZ處理組：小鼠體內植入CAZ納米粒包被導管。所有小鼠在感染后的指定時間脫頸處死。每組每天處死5只小鼠，試驗重復3次。

1.3.6膀胱組織和導管表面細菌菌落計數(shù) 經(jīng)下腹部正中線切口迅速取出膀胱，稱質量，加入1 mL生理鹽水，用研磨器研磨成勻漿。導管取出后放入裝有1 mL生理鹽水的離心管中，超聲處理15～20 min，然后渦旋混勻。用生理鹽水按照10倍濃度梯度將組織或導管進行稀釋，取每個濃度稀釋液1 mL分裝于無菌培養(yǎng)皿中，再加入9 mL無菌的LB固體培養(yǎng)基混勻，37 ℃培養(yǎng)過夜。采用平板菌落計數(shù)法進行細菌計數(shù)。

1.3.7膀胱組織病理觀察[蘇木素-伊紅(HE)染色] 首先使用梯度乙醇為膀胱組織脫水，每次30 min。脫水完成后， 用二甲苯透明；將已經(jīng)透明后的組織塊置于已經(jīng)融化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫，待石蠟完全浸入組織后進行包埋；將包埋好的石蠟塊固定于切片機上，切成5～8 μm厚的薄片。切下的薄片往往皺褶，需放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放45 ℃恒溫箱中烘干；用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經(jīng)梯度乙醇脫水，最后入蒸餾水，就可行HE染色；染色后的切片經(jīng)100%乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯透明，樹膠封片，蓋上蓋玻片，貼標簽，在光學顯微鏡下進行觀察。

1.3.8細胞因子定量免疫分析 采用ELISA試劑盒對小鼠膀胱組織勻漿上清液白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-10細胞因子進行定量檢測，實驗重復3次。

2 結 果

2.1CAZ納米粒載藥量及導管表面藥物總量的測定 經(jīng)HPLC測定，載CAZ的PLGA納米粒載藥量為(6.56±1.24)%，每1厘米導管表面所含藥物總量為(10.48±0.04)μg。

2.2CAZ納米粒包被導管的體外釋藥率 結果顯示，7 d內導管表面CAZ累積釋放量為71.34%。其中前4 d釋放速度較快，累積釋放量達到64.46%，見圖1。

圖1 CAZ納米粒包被導管的體外藥物累積釋放量

2.3CAZ納米粒包被導管的體外抑菌活性檢測 未包被導管7 d內均無抑菌圈出現(xiàn)，而CAZ納米粒包被導管周圍抑菌圈大小在(17.7±2.2)～(28.2±3.3) mm，表明CAZ納米粒包被導管具有較好的抗菌作用，見圖2。

圖2 CAZ納米粒包被導管對銅綠假單胞菌的抗菌活性

2.4膀胱組織和導管表面細菌菌落計數(shù) 采用菌落平板計數(shù)法對小鼠的膀胱組織和導管表面進行細菌學分析，空白對照組小鼠膀胱組織平均細菌量增加，從感染后第1天的3.8 logCFU/g到第7天的7.1 logCFU/g；然而CAZ處理組在感染后第1～4天小鼠膀胱組織細菌平均值小于1.0 logCFU/g，第7天未檢測到細菌(圖3A)?？瞻讓φ战M導管表面細菌數(shù)從第1天的4.9 logCFU/植入物增加到第7天的6.5 logCFU/植入物；相反，CAZ的存在限制了細菌在植入物表面上的定植，第1～7天導管表面的細菌數(shù)均小于1.0 logCFU /植入物(圖3B)。

A：膀胱組織；B：導管表面；a:P<0.01,與空白對照組比較

圖3小鼠膀胱組織和植入物表面細菌菌落計數(shù)結果

2.5小鼠膀胱組織病理觀察結果 在感染后第1天，空白對照組小鼠膀胱組織有上皮細胞脫落，且伴有中性粒細胞浸潤(圖4A)，而CAZ處理組小鼠膀胱表現(xiàn)出上皮細胞有部分脫落，出現(xiàn)輕微炎癥(圖4B)。7 d后，空白對照組小鼠膀胱有大量上皮細胞脫落、壞死，并伴有中性粒細胞浸潤，存在水腫(圖4C)，但是CAZ處理組膀胱炎癥細胞部分增加，膀胱組織比較完整，沒有明顯的炎癥信號(圖4D)。

2.6細胞因子水平定量免疫分析 空白對照組小鼠膀胱組織促炎性細胞因子IL-6和TNF-α水平隨感染后天數(shù)增加而升高，且CAZ處理組兩種細胞因子水平顯著低于空白對照組(P<0.01)。然而，空白對照組抗炎性細胞因子IL-10水平雖然隨感染后天數(shù)增加而升高，但CAZ處理組IL-10水平顯著高于空白對照組(P<0.01)，見圖5。

A:空白組感染第1天；B：CAZ處理組感染第1天；C：空白組感染后第7天；D：CAZ組感染第7天

圖4小鼠膀胱組織石蠟切片HE染色(×100)

A：IL-6；B：TNF-α;C：IL-10；a：P<0.01,與空白對照組比較

圖5小鼠膀胱IL-6、TNF-α和IL-10細胞因子水平測定

3 討 論

尿路感染(UTI)是醫(yī)院獲得性感染最常見的類型之一，約80%院內尿路感染與尿道插管有關，尿道導管內缺乏免疫，益于細菌定值，為尿路致病菌進入膀胱創(chuàng)造了條件[9-10]。由于銅綠假單胞菌能夠在尿道導管表面形成難以清除的生物膜，因此銅綠假單胞菌介導的CAUTI的發(fā)病機制非常復雜。本研究中的藥物釋放數(shù)據(jù)顯示CAZ納米粒包被導管能夠持續(xù)釋放藥物，且釋放濃度高于其最小抑菌濃度(MIC)，可有效預防CAUTI，而且即使藥物以亞MIC濃度釋放時也可避免耐藥的發(fā)生。體外抑菌活性檢測結果顯示CAZ可以保持較強的抗菌活性，表明導管表面的藥物可以持續(xù)釋放。這與其他抗菌藥物涂抹導管的抗菌作用相似[11]。

膀胱組織中的細菌數(shù)量與所有時間點取出的植入物表面的細菌量相關。有研究報道腸球菌感染小鼠膀胱炎模型中，膀胱植入尿道導管7 d后其膀胱和腎臟中細菌數(shù)增加及植入物表面生物膜形成增加[12]，這與本研究結果一致。此外，有文獻報道兔子CAUTI模型中羥磷灰石納米粒包被導管表面生物膜形成較未包被導管減少和尿路上皮組織無明顯病理特征[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)CAZ納米粒包被導管后其更能抵抗細菌定植和生物膜形成。病理切片結果顯示CAZ納米粒包被植入物幾乎不影響膀胱組織病理，其異物介導的輕微炎癥歸因于宿主的免疫反應，它能夠克服未包被植入物引起的嚴重炎癥，并不出現(xiàn)水腫、淋巴細胞增多等癥狀。提示CAZ納米粒包被導管在預防和治療銅綠假單胞菌引起的CAUTI方面具有一定的臨床療效。

宿主對銅綠假單胞菌引起的尿路感染的有效防御主要取決于非特異性抗菌防御機制[14]。TNF-α 和 IL-6 是重要的炎癥介質，具有調節(jié)免疫應答，在機體的抗感染中參與免疫反應，是引起免疫細胞發(fā)生功能紊亂的重要促發(fā)因子，最終可導致重要器官的衰竭。IL-10是一種具有抗炎、抗免疫和抗纖維化作用的免疫抑制性因子，通過抑制Th1細胞的增殖而發(fā)揮其抗炎作用。有研究報道在糞腸球菌感染的小鼠CAUTI模型中，膀胱植入導管后IL-1β、IL-6、IL-12和IL-17炎癥因子表達均上調[15]。本研究膀胱組織中細胞因子水平檢測結果顯示植入CAZ納米粒包被導管后降低了植入物介導的炎癥作用，提示CAZ納米粒包被導管提高了宿主對感染的免疫反應。總之，本研究顯示CAZ納米粒包被導管可以在體內釋放有效的藥物濃度而防止銅綠假單胞菌的黏附和生物膜形成，因此為臨床醫(yī)生有效控制銅綠假單胞菌引起的CAUTI帶來了希望，同時也為抗菌藥物納米粒包被導管治療其他尿路致病菌引起的各種疾病提供了參考依據(jù)。