李亞輝， 周劍忠， 馬艷弘， 張宏志， 王 英

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

藍(lán)莓，俗稱越桔，是杜鵑科越橘屬野生落葉灌木漿果，果實(shí)球形或橢圓形，成熟后為藍(lán)紫色，果皮表面有白霜[1]。藍(lán)莓原產(chǎn)于歐美，世界上有450多個(gè)品種，我國(guó)有91個(gè)種28個(gè)變種，主要分布于東北和西南地區(qū)，共中兔眼品種藍(lán)莓在我國(guó)南方地區(qū)有較大面積的種植[2]。藍(lán)莓果實(shí)色澤鮮艷、酸甜可口、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，尤其是花色苷和多酚含量位居果蔬之首[3-4]。藍(lán)莓具有抗氧化、防衰老等多種功效，不僅可以防治各種疾病還可以增強(qiáng)人體健康，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能[5]。

藍(lán)莓酒是一種新興果酒，是以藍(lán)莓為原料的生物發(fā)酵制品。其不僅最大程度地保留了藍(lán)莓原果中的營(yíng)養(yǎng)成分，而且通過(guò)發(fā)酵還產(chǎn)生了大量生物活性物質(zhì)，因此被譽(yù)為“液體黃金”、“酒中皇后”和“口服的人類化妝品”[6]。渾濁沉淀是藍(lán)莓酒生產(chǎn)中常見(jiàn)的問(wèn)題，尤其是裝瓶后產(chǎn)生渾濁沉淀將會(huì)大大影響其品質(zhì)和商品形象。澄清穩(wěn)定處理是藍(lán)莓酒生產(chǎn)中的重要步驟，也是解決果酒渾濁沉淀的主要方法，它可使果酒獲得良好的澄清度和穩(wěn)定性[7]。澄清穩(wěn)定處理的方法主要有離心、下膠、過(guò)濾、熱處理、冷處理、添加穩(wěn)定劑等[8-9]。通過(guò)澄清穩(wěn)定處理，酒體獲得良好澄清度，變得清澈透亮，并且處于穩(wěn)定狀態(tài)長(zhǎng)期保持這一澄清度。但在果酒發(fā)酵結(jié)束后，任何的處理都是以犧牲果酒的質(zhì)量為代價(jià)的，因此應(yīng)將對(duì)酒的處理降至最小程度。

本文作者在課題組前期對(duì)藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理方法優(yōu)化的基礎(chǔ)上，研究了澄清穩(wěn)定處理過(guò)程中藍(lán)莓酒組分和生物活性的變化，以期為在藍(lán)莓酒后處理中保證藍(lán)莓酒品質(zhì)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓酒（兔眼藍(lán)莓釀造，12.1%），句容萬(wàn)山紅遍生物科技有限公司提供。

硅藻土、皂土，上海杰兔工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、碘標(biāo)準(zhǔn)液、NaOH標(biāo)準(zhǔn)液、菲林試劑，深圳市博林達(dá)科技有限公司產(chǎn)品；沒(méi)食子酸標(biāo)品，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；福林試劑，上海荔達(dá)生物科技有限公司產(chǎn)品；FeSO4、VC、鄰苯三酚、鐵氰化鉀，天津科密歐試劑公司產(chǎn)品；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

酒精計(jì)、玻璃整流器、密度瓶，上海玻璃儀器廠制造；控溫冰箱，北京福意聯(lián)電器有限公司產(chǎn)品；pH酸度計(jì)，梅特勒-托利多產(chǎn)品；砂芯過(guò)濾器，德州潤(rùn)昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，蘇州蘇凈凈化設(shè)備廠制造；LRH-150生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；DSX-280B手提式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠制造；7890氣相色譜儀、5975C質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；萃取頭，美國(guó)Supelco公司產(chǎn)品；UV-3802H紫外可見(jiàn)分光光度儀，上海尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯加熱磁力攪拌器，上海越眾儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 澄清穩(wěn)定處理步驟

發(fā)酵結(jié)束→自然澄清→硅藻土過(guò)濾→下膠處理→冷凍處理→硅藻土過(guò)濾→微濾

操作要點(diǎn)：自然澄清溫度為15～20℃，時(shí)間為1個(gè)月；硅藻土松散密度為0.10～0.20；微濾濾膜孔徑為 0.45 μm。

其他操作要點(diǎn)及參數(shù)參照李亞輝等優(yōu)化的藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理方法[10]。

1.3.3 全瓷貼面試戴與粘接臨床試戴、粘接 制作完成后試戴貼面，檢查其形態(tài)、質(zhì)地、顏色和邊緣適合性，必要時(shí)對(duì)貼面作適當(dāng)?shù)恼{(diào)改。通過(guò)試戴后，選用合適的樹(shù)脂水門汀進(jìn)行粘接，調(diào)整咬合，并進(jìn)行打磨拋光。記錄每單位修復(fù)體試戴、調(diào)改至患者滿意或可接受所花費(fèi)的時(shí)間。所有入選病例的臨床操作均由同一位高年資主治醫(yī)師完成，瓷貼面的制作及拋光、上釉等均由同一位技師完成。2組患者在治療結(jié)束后均予以口腔衛(wèi)生健康指導(dǎo)，使其掌握正確的刷牙方法，并養(yǎng)成良好的口腔衛(wèi)生習(xí)慣。

通過(guò)上述處理的藍(lán)莓酒澄清度和色度分別為0.749和1.128，和沒(méi)有進(jìn)行處理的相比具有良好的澄清度、無(wú)潛在的蛋白質(zhì)破敗和色素沉淀，且在長(zhǎng)時(shí)間瓶?jī)?chǔ)中具有良好的澄清度和色度穩(wěn)定性。

取樣：每個(gè)處理步驟結(jié)束后取樣一次，除測(cè)定微生物指標(biāo)外，其余樣品放－4℃冰箱待測(cè)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 理化指標(biāo)測(cè)定 pH值采用酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

酒精度、總糖、總酸、總SO2、游離SO2和干浸出物參照國(guó)標(biāo)GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2 微生物指標(biāo)測(cè)定 菌落總數(shù)測(cè)定：參照GB 4789.2-2010《菌落總數(shù)測(cè)定》；酵母菌數(shù)測(cè)定：參照GB 4789.15-2010《霉菌和酵母計(jì)數(shù)》。

1.4.3 揮發(fā)性香氣物質(zhì)測(cè)定 參照曹雪丹等所述方法[11]。氣相色譜條件為：程序升溫，40℃ 保持3 min，以3℃/min升至160℃，2 min后，以8℃/min升至220℃ ，3 min后，進(jìn)樣口溫度達(dá)250℃。質(zhì)譜條件：電子能量 70 eV，離子源溫度 230℃。定性分析：氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行分析鑒定，計(jì)算各個(gè)色譜峰的保留指數(shù)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)進(jìn)行檢索及分析，確認(rèn)檢測(cè)物成分。

1.4.4 多酚質(zhì)量濃度測(cè)定 總酚質(zhì)量濃度測(cè)定。參照牛雪等所述福林酚法[12]：取樣品0.1 mL，蒸餾水為空白，加濃度為1 mol/L的福林酚試劑0.1 mL和60 g/L碳酸鈉溶液0.8 mL，在微波爐中檔下處理20 s后，在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值。結(jié)果以每升樣品中含有相當(dāng)沒(méi)食子酸的克數(shù)表示。

總花色苷質(zhì)量濃度測(cè)定。參照孫婧超等所述pH示差法進(jìn)行花色苷含量測(cè)定[13]。計(jì)算公式如（1）

1.4.5 抗氧化活性測(cè)定 DPPH自由基清除能力測(cè)定。參照Atoui et al.所述方法[14]：取1 mL樣品，蒸餾水為空白，對(duì)照組用0.4 mg/mL的Vc溶液代替樣品。

式（2）中A1為樣品組的吸光值；A0為對(duì)照組的吸光值。

超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定。參照胡翠珍等所述方法[15]：以Tris-HCl緩沖液作參比，在320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度A1，以等體積的蒸餾水代替樣品和鄰苯三酚溶液，測(cè)對(duì)照吸光度A0，計(jì)算清除率，如式（3）。

還原力測(cè)定。參照黃曉杰等所述方法[16]：取樣品0.1 mL，蒸餾水為空白，加磷酸鈉緩沖液2.5 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合均勻，置于50℃水浴20 min后冷卻。然后加體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混合均勻。取反應(yīng)液5 mL，加蒸餾水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%氯化鐵溶液各5 mL，混合均勻，于700 nm處測(cè)量吸光值A(chǔ)。吸光度值越高表明還原力越強(qiáng)。

總抗氧化活性測(cè)定。參照李亞輝等所述FRAP法[17]：取1 mL樣品，蒸餾水為空白，對(duì)照用0.4 mg/mL的VC溶液代替，每個(gè)樣品重復(fù)3次。以1.0 mmol/L FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光值所需FeSO4的濃度（μmol/L）表示，定義為FRAP值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，利用Excel和SPSS18.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)的變化

藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理中理化指標(biāo)的變化如表1所示。由表1可知，pH值和總酸質(zhì)量濃度在處理過(guò)程中有一定的變化，但變化較小，冷凍處理后pH值有較小的增加，總酸質(zhì)量濃度有較小的減少，但沒(méi)有顯著性差異。冷凍處理后pH值和總酸質(zhì)量濃度較小的變化，可能是因?yàn)槔鋬鎏幚韺?dǎo)致酒中部分酸鹽達(dá)到飽和狀態(tài)，并結(jié)晶析出，從而使總酸質(zhì)量濃度降低、pH值升高[18]。這說(shuō)明冷凍處理可在一定程度上降低藍(lán)莓酒的酸度，改善藍(lán)莓酒的口感，但效果不明顯。發(fā)酵結(jié)束后，總糖質(zhì)量濃度在4 g/L以下，達(dá)到了干酒的標(biāo)準(zhǔn)，在整個(gè)處理過(guò)程中總糖質(zhì)量濃度幾乎沒(méi)有變化，一直維持在3.75 g/L左右。酒精度在處理過(guò)程中逐漸降低，硅藻土過(guò)濾對(duì)酒精度的變化影響較大，可能是在過(guò)濾過(guò)程中酒精揮發(fā)引起的酒精度降低。這說(shuō)明在處理過(guò)程中應(yīng)盡量減少硅藻土過(guò)濾的次數(shù)和時(shí)間，以避免酒精的損失?？偠趸蚝陀坞x態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度在處理過(guò)程中有較顯著的降低，硅藻土過(guò)濾對(duì)總二氧化硫質(zhì)量濃度有較大的影響，使其顯著降低；硅藻土過(guò)濾和下膠處理對(duì)游離態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度有較大的影響，使其顯著降低；處理結(jié)束后總二氧化硫質(zhì)量濃度降低了28.6%，游離態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度降低了55.6%，處理過(guò)程對(duì)游離態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度的影響顯著大于對(duì)總二氧化硫質(zhì)量濃度的影響。二氧化硫是果酒釀造中重要的輔料，可以起到殺菌和抗氧化的作用。酒中二氧化硫分為結(jié)合態(tài)和游離態(tài)，只有游離態(tài)二氧化硫才具有抗氧化性和殺菌性，因此要在保持總二氧化硫質(zhì)量濃度一定的情況下，盡量提高游離態(tài)二氧化硫的質(zhì)量濃度[19]。此結(jié)果說(shuō)明，澄清穩(wěn)定處理對(duì)二氧化硫質(zhì)量濃度尤其是游離態(tài)二氧化硫含量有較大影響，因此要進(jìn)一步優(yōu)化澄清穩(wěn)定處理?xiàng)l件使其對(duì)游離態(tài)二氧化硫的影響降到最低，或是在處理后及時(shí)補(bǔ)加一定量的二氧化硫，提高游離態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度，使藍(lán)莓酒保持一定的抗菌能力和抗氧化能力。干浸出物在處理過(guò)程中也有顯著降低，其中自然澄清、第一次硅藻土過(guò)濾和下膠處理對(duì)其影響較大，使其質(zhì)量濃度顯著降低。發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒體較為渾濁，含有大量雜質(zhì)，因此自然澄清后干浸出物有較大的降低；第一次硅藻土過(guò)濾除去了部分色素和一些較小顆粒的固形物因此造成干浸出物質(zhì)量濃度降低；下膠處理除去了不穩(wěn)定色素、蛋白質(zhì)和其他懸浮性雜質(zhì)從而造成干浸出物質(zhì)量濃度降低。此結(jié)果說(shuō)明應(yīng)盡量簡(jiǎn)化澄清穩(wěn)定處理步驟，以減少對(duì)酒中干物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響。

表1 澄清穩(wěn)定處理中藍(lán)莓酒理化指標(biāo)的變化Table 1 Changes of physical and chemical index during clarification and stabilization process of blueberry wine

2.2 微生物指標(biāo)的變化

藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理中微生物指標(biāo)的變化如圖1所示。由圖1可知，酵母菌和總菌落數(shù)量、變化趨勢(shì)均一致，沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明發(fā)酵結(jié)束后酵母菌是酒中主要微生物。酵母菌在澄清穩(wěn)定處理過(guò)程中數(shù)量逐漸減少，自然澄清、硅藻土過(guò)濾和微濾使酵母菌數(shù)量顯著減少，下膠和冷處理使酵母菌數(shù)量有一定的減少，但不顯著。自然澄清階段酒中碳源已基本被耗盡，大量酵母菌死亡，因此其數(shù)量大大減少；硅藻土過(guò)濾可除去部分酵母菌，因此也使其數(shù)量大大減少；下膠和冷處理促使部分酵母菌絮凝沉淀，從一定程度上抑制了酵母菌活性；微濾起到除菌作用，使酒處于無(wú)菌狀態(tài)。此結(jié)果說(shuō)明澄清穩(wěn)定處理可以除去酒中微生物，使其達(dá)到較好的生物穩(wěn)定性。

2.3 揮發(fā)性香氣物質(zhì)的變化

圖1 澄清穩(wěn)定處理中微生物數(shù)量的變化Fig.1 Changes of microbe quantity during clarification and stabilization process

揮發(fā)性香氣物質(zhì)是葡萄酒和其他果酒的重要組成成分，是形成果酒不同風(fēng)味的重要物質(zhì)和果酒感官評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[20-21]。藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的變化如表2所示。由表2可知，澄清穩(wěn)定處理前后揮發(fā)性香氣物質(zhì)的數(shù)量有較大變化，處理前共檢測(cè)出38種物質(zhì)，其中醇類5種、酯類11種、酸類4種、帖類10種、烴類8種；第一次硅藻土過(guò)濾后檢測(cè)出33種物質(zhì)，其中醇類5種、酯類9種、酸類4種、帖類9種、烴類6種；冷凍處理后檢測(cè)出31種物質(zhì)，其中醇類5種、酯類8種、酸類3種、帖類10種、烴類5種；第二次硅藻土過(guò)濾后檢測(cè)出26種物質(zhì)，其中醇類3種、酯類6種、酸類3種、帖類8種、烴類6種；處理后檢測(cè)出25種物質(zhì)，其中醇類3種、酯類6種、酸類3種、帖類7種、烴類5種。此結(jié)果說(shuō)明澄清穩(wěn)定處理對(duì)藍(lán)莓酒香氣物質(zhì)有較大影響，大大減少了其數(shù)量。同時(shí)也表明了我們要進(jìn)一步優(yōu)化澄清穩(wěn)定處理工藝、減少處理步驟，降低其對(duì)揮發(fā)性香氣物質(zhì)的影響、提高藍(lán)莓酒的整體品質(zhì)。

表2 澄清穩(wěn)定處理前后揮發(fā)性香氣物質(zhì)的變化Table 2 Changes of volatile aroma components before and after clarification and stabilization process

2.4 多酚質(zhì)量濃度的變化

藍(lán)莓及其制品因富含多酚物質(zhì)而成為保健品市場(chǎng)的新寵，多酚是藍(lán)莓中重要的抗氧化物質(zhì)，藍(lán)莓多酚主要包括原花青素、花色苷、黃酮和單寧等，其中花色苷是最重要也是含量最高的多酚物質(zhì)[22-23]。本試驗(yàn)主要對(duì)藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理中總酚和總花色苷質(zhì)量濃度的變化進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在澄清穩(wěn)定處理中總酚和總花色苷質(zhì)量濃度逐漸降低，且兩者具有相同的變化趨勢(shì)。澄清穩(wěn)定處理后總酚質(zhì)量濃度下降了約30%，總花色苷質(zhì)量濃度下降了約24%。下膠和冷凍處理對(duì)總酚和總花色苷質(zhì)量濃度的影響較大，而自然澄清、硅藻土過(guò)濾和微濾對(duì)兩者質(zhì)量濃度的影響較小。這可能是因?yàn)橄履z和冷凍處理促進(jìn)了酒中游離花色苷和其他不穩(wěn)定多酚物質(zhì)的絮凝沉淀[24]，從而造成總酚和總花色苷質(zhì)量濃度大幅下降。澄清穩(wěn)定處理除去的主要是游離態(tài)花色苷和其他不穩(wěn)定雜質(zhì)，因?yàn)樗鼈兪窃斐晒茰啙岢恋淼闹饕蛩?。這說(shuō)明過(guò)度的追求果酒的澄清度，勢(shì)必會(huì)造成其營(yíng)養(yǎng)成分的損失。

圖2 澄清穩(wěn)定處理中多酚質(zhì)量濃度的變化Fig.2 Changes of polyphenols quantity during clarification and stabilization process

2.5 抗氧化活性的變化

藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理中抗氧化性的變化如圖3所示，其中DPPH自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率的變化如圖3（a）所示，還原力和總抗氧化性的變化如圖 3（b）所示。 由圖 3（a）可知，DPPH 自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率在澄清穩(wěn)定處理中均逐漸降低，澄清穩(wěn)定處理后DPPH自由基清除率下降了約32%，超氧陰離子自由基清除率下降了約24%。下膠和冷凍處理對(duì)2個(gè)清除率的影響較大，而自然澄清、硅藻土過(guò)濾和微濾對(duì)其影響較小。2個(gè)清除率的變化趨勢(shì)與總酚和總花色苷質(zhì)量濃度的變化趨勢(shì)一致，這可能是由總酚和總花色苷質(zhì)量濃度的降低引起的。由圖3（b）可知，還原力和總抗氧化性在澄清穩(wěn)定處理中也逐漸降低，澄清穩(wěn)定處理后兩者分別下降了約14%和25%。其中硅藻土過(guò)濾、下膠處理和冷凍處理對(duì)還原力和總抗氧化性的變化影響較大。澄清穩(wěn)定處理中還原力和總抗氧化性降低，可能是由于總酚質(zhì)量濃度和游離態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度降低引起的。此結(jié)果說(shuō)明澄清穩(wěn)定處理降低了藍(lán)莓酒的抗氧化活性，進(jìn)一步說(shuō)明了對(duì)酒體的任何處理都是以犧牲酒的內(nèi)在品質(zhì)為代價(jià)的。

圖3 澄清穩(wěn)定處理中抗氧化活性的變化Fig.3 Changes of antioxidant activity during during clarification and stabilization process

3 結(jié) 語(yǔ)

本文作者通過(guò)對(duì)藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理過(guò)程中理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)、揮發(fā)性香氣物質(zhì)、多酚質(zhì)量濃度和抗氧化性的測(cè)定，研究了其在澄清穩(wěn)定處理中組分和抗氧化性的變化。結(jié)果表明：在澄清穩(wěn)定處理中，總糖質(zhì)量濃度沒(méi)有變化；pH值和總酸質(zhì)量濃度有一定的變化，但變化較?。痪凭仍谔幚磉^(guò)程中逐漸降低，但沒(méi)有顯著差異；總二氧化硫和游離態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度顯著降低，硅藻土過(guò)濾和下膠處理對(duì)其影響較大；干浸出物質(zhì)量濃度顯著降低，自然澄清、硅藻土過(guò)濾和下膠處理對(duì)其影響較大。澄清穩(wěn)定處理后揮發(fā)性香氣物質(zhì)的數(shù)量大大減少，由處理前的38種減少為25種。澄清穩(wěn)定處理中總酚和總花色苷質(zhì)量濃度顯著降低，下膠和冷凍處理步驟對(duì)兩者質(zhì)量濃度影響較大。DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、還原力和總抗氧化性均有顯著降低。此結(jié)果說(shuō)明澄清穩(wěn)定處理降低了藍(lán)莓酒的營(yíng)養(yǎng)成分和功能活性，我們應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化并盡量減少對(duì)其處理步驟，保證其內(nèi)在品質(zhì)。