陳湘君， 劉靖

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

痤瘡，又稱青春痘，是由多種因素引起的一種皮脂腺慢性炎癥性疾病，好發(fā)于臉面部、胸部、背部等皮脂腺豐富的部位，表現(xiàn)為丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)等多種皮損形式[1]。據(jù)統(tǒng)計，其在青少年的發(fā)病率高達80%，人群發(fā)病率約為9.4%。痤瘡病程較長，是一種損容性皮膚病，不僅給患者帶來經(jīng)濟負擔，還帶給患者精神上的壓力[2，3]?，F(xiàn)代醫(yī)學治療痤瘡主要是運用抗感染、抑制油脂分泌、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等手段。近年來，越來越多的臨床數(shù)據(jù)顯示，在西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上，配合中醫(yī)藥的辨證論治，往往能取得更好的治療效果[4，5]。

白芷為傘形科植物白芷的干燥根莖，性溫，味辛、微苦，具有祛風解表、消癰散結(jié)、排膿生肌的功效。臨床上白芷及其制劑常被廣泛應(yīng)用于痤瘡的治療。藥理研究[6-9]表明，白芷提取物具有一定的鎮(zhèn)痛、抗炎、抑制皮脂腺分泌的作用。白芷對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等細菌均有不同程度的抑制作用。

對于白芷治療痤瘡療效的研究目前主要通過臨床試驗或動物實驗進行，其所含的活性成分及具體作用機制尚未被闡明。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學為基礎(chǔ)，篩選出白芷的活性成分，尋找其作用靶標及涉及的信號通路，最終建立起“成分——靶標——通路——疾病”網(wǎng)絡(luò)，以探究白芷治療痤瘡的具體作用機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1藥物活性成分的獲取利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“白芷”為關(guān)鍵詞檢索，獲得白芷所含有的所有化學成分的信息。由于中藥所含化學成分眾多，故設(shè)置限定條件為“利用度（OB）值≥30%，且類藥性（DL）值≥0.18”，將篩選后得到的化學成分作為白芷的活性成分。

1.2活性成分作用靶標的獲取用Chembiodraw Ultra 12.0軟件繪制白芷活性成分的3D結(jié)構(gòu)圖，保存為mol2格式。將所有mol2文件上傳至反向分子對接服務(wù)器（DRAR-CPI）（https：//omictools.com/drar-cpi-tool），為所有活性成分與靶標蛋白相互作用的親和度打分，選取Z-score＜-0.5的蛋白作為白芷活性成分的預(yù)測靶標。在Uniport數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中搜索白芷活性成分預(yù)測靶標的PDB ID，限定物種為“human”，收集預(yù)測靶標相對應(yīng)的基因及UniProtKB。

1.3痤瘡相關(guān)靶標基因的獲取以“acne”或“acne vulgaris”或“common acne”作為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/）中檢索與痤瘡相關(guān)的靶標基因。將檢索得到的靶標基因和白芷活性分子的預(yù)測靶標基因進行對比，篩選出兩者之間的共同靶標基因，作為白芷治療痤瘡的潛在作用靶標。

1.4成分——靶標網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將白芷的活性成分與其治療痤瘡的潛在作用靶標關(guān)系導入Cytoscape 3.6.0軟件，構(gòu)建出成分——靶標網(wǎng)絡(luò)。

1.5潛在作用靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將白芷治療痤瘡的潛在作用靶標導入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），限定物種為“human”，獲得預(yù)測靶標的相互作用關(guān)系，保存為TSV格式。將靶標之間的相互作用關(guān)系導入Cytoscape 3.6.0軟件中，繪制“核心靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)”，通過軟件中的Network Analyzer工具進行網(wǎng)絡(luò)分析，并根據(jù)Degree值（連接度）的大小調(diào)節(jié)節(jié)點的大小和顏色，獲取最終的蛋白核心靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.6分子對接分子對接是通過電腦模擬受體與配體結(jié)合的過程，計算出一系列物理化學參數(shù)，以預(yù)測兩者的結(jié)合親和性的一種。篩選出蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中Degree值最高的5個靶標，將其導入System Dock Web Site（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）服務(wù)器中與白芷活性成分進行分子對接，對結(jié)果的Docking評分進行分析，評估白芷活性成分與核心靶標之間的結(jié)合潛力。

1.7生物學過程與通路分析將白芷的作用靶標導入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），進行基因本體論（GO）分類富集分析與京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。選取P＜0.001的通路，并根據(jù)富集在通路上的基因數(shù)目，由大到小進行排序，選取排名前20的通路，使用OmicShare網(wǎng)站（http：//www.omicshare.com/tools/）繪制氣泡圖。

1.8成分——靶標——通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過對篩選得到的20條通路的KEGG通路富集分析，結(jié)合文獻檢索的結(jié)果，篩選出可能與治療痤瘡相關(guān)的通路，找出富集在這些通路上白芷治療痤瘡的靶點，并與相應(yīng)藥物的活性成分相匹配，構(gòu)建“成分——靶標——通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1白芷活性成分與相應(yīng)靶標共收集到白芷化學成分223個。以口服OB≥30%、DL≥0.18作為限定條件，篩選出活性成分20個，見表1。將活性成分的3D結(jié)構(gòu)圖上傳至DRAR-CPI服務(wù)器，獲得Z-score＜-0.5的靶標共有61個。

表1 白芷活性成分表Table 1 Active components in Radix Angelicae Dahuricae

2.2靶標預(yù)測將61個靶標輸入UniProt數(shù)據(jù)庫，獲得61個靶標的相應(yīng)基因及其UniProtKB。從GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中搜索得到與痤瘡相關(guān)基因共924個。將白芷的靶標基因與痤瘡相關(guān)基因進行對比，篩選出可能與白芷治療痤瘡相關(guān)的作用靶標55個，見表2。

表2 白芷治療痤瘡潛在作用靶標信息表Table 2 The information of potential candidate targets of Radix Angelicae Dahuricae UniProtKB

2.3成分——靶標網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在Cytoscape軟件中導入白芷的活性成分與作用靶標，構(gòu)建成分——靶標網(wǎng)絡(luò)，見圖1。此網(wǎng)絡(luò)共包括節(jié)點75個，邊156條。不同的節(jié)點有不同的意義，其中藍色六邊形節(jié)點代表活性成分，綠色圓形節(jié)點代表作用靶標，而邊則代表成分與靶標的關(guān)系。由圖1可知，不同的靶標可對應(yīng)相同的活性成分，同一靶標也可與不同的活性成分相對應(yīng)，可見白芷治療痤瘡具有多成分、多靶標的特點。

圖1 白芷成分——靶標網(wǎng)絡(luò)Figure 1 The component-target network of Radix Angelicae Dahuricae

2.4核心靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將可能與白芷治療痤瘡相關(guān)的55個靶標導入String數(shù)據(jù)庫中，獲取其相互作用關(guān)系，并導入Cytoscape 3.6.0軟件中，繪制其相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2。此網(wǎng)絡(luò)共包括節(jié)點55個，邊239條。Degree值越大則圖中節(jié)點越大、顏色越深。結(jié)果提示白芷治療痤瘡相關(guān)的潛在靶標中Degree值最高的5個靶點為包括白細胞介素（IL）、JUN、金屬蛋白酶組織抑制因子2（TIMP-2）、血清胰島素樣生長因子1（IGF-1）、雄激素受體（AR）。

圖2 白芷治療痤瘡潛在靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 2 The interaction network of candidate targets of Radix Angelicae Dahuricae

圖3 分子對接圖Figure 3 The diagram of molecular docking

2.5分子對接選取Degree值最大的5個靶標，將其分別輸入Systems Dock Web Site軟件中，進行分子對接驗證，并與白芷的20個活性成分進行對接，見圖2。結(jié)果顯示：有18個（18%）的Docking Score值＞7.0（結(jié)合能力很高），有41個（41%）的Docking Score值在7.0～5.0之間（結(jié)合能力較高），有29個（29%）的Docking Score值在5.0～4.25之間（有一定的結(jié)合能力），有12個（12%）的Docking Score值＜4.25。由此可見，白芷的活性成分和關(guān)鍵靶標的結(jié)合能力較好。

2.6 GO和KEGG通路富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫對白芷治療痤瘡的潛在靶標進行GO分類富集和KEGG通路富集分析。篩選P＜0.001的通路與生物過程，其中富集靶標越多、P值越小的通路，與白芷治療痤瘡的關(guān)系越為密切。GO分類富集分析包括細胞組分（cellular component，CC）、生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）3個部分。其中富集比例較高、P值較小的在CC分析中為漿膜（plasma membrane）、細胞 核（nucleus）、 細 胞 質(zhì)（cytoplasm）、 胞 液（cytosol）、漿膜成分（integral component of plasma membrane）等，見圖4。BP分析中為信號轉(zhuǎn)導（signal transduction）、藥物應(yīng)答（response to drug）、細胞增殖正調(diào)控（positive regulation of cell proliferation）、雌二醇應(yīng)答（response to estradiol）、脂多糖應(yīng)答（response to lipopolysaccharide）等，見圖5。MF分析中為蛋白綁定（protein binding）、酶綁定（enzyme binding）、蛋白同源二聚化活性（protein homodimerization activity）、蛋白異源二聚化活性（protein heterodimerization activity）、藥物綁定（drug binding）等，見圖6。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)白芷治療痤瘡的靶標主要與磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶Akt、核因子kappaB（NF-κB）、人類T淋巴細胞白血病病毒Ⅰ型（HTLV-1）感染、Nrf2、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等通路關(guān)系較為密切，見圖7。

圖4 白芷治療痤瘡的潛在靶標的CC分析Figure 4 GO pathway enrichment analysis for cellular component of candidate targets from active components of Radix Angelicae Dahuricae for acne

圖5 白芷治療痤瘡的潛在靶標的BP分析Figure 5 GO pathway enrichment analysis for biological processes of candidate targets from active components of Radix Angelicae Dahuricae for acne

圖6 白芷治療痤瘡的潛在靶標的MF分析Figure 6 GO pathway enrichment analysis for molecular function of candidatetargets from active components of Radix Angelicae Dahuricae for acne

圖7 白芷治療痤瘡的潛在靶標的KEGG通路富集分析Figure 7 KEGG pathway enrichment analysis of candidate targets from active components of Radix Angelicae Dahuricae for acne

2.7成分——靶標——通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過檢索與閱讀文獻，在排名前20的KEGG通路中篩選出可能與治療痤瘡相關(guān)的通路，并將其與白芷的活性成分、作用靶標三者結(jié)合，構(gòu)建成分——靶標——通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖8。其中藍色三角形節(jié)點代表與白芷治療痤瘡相關(guān)的活性成分，綠色圓形節(jié)點代表潛在靶標，紫色六邊形節(jié)點代表與痤瘡相關(guān)通路。分析成分——靶標——通路網(wǎng)絡(luò)圖可知，白芷治療痤瘡涉及的活性成分共10個，包括別歐前胡素（Prangenidin）、別異歐前胡素（Alloisoimperatorin）、異珊瑚菜素（Cnidilin）、歐前胡素（Ammidin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、新比克白芷內(nèi)酯（neobyakangelicol）、白當歸腦（Byakangelicol）、珊瑚菜內(nèi)酯（Phellopterin）、C型凝集素受體（CLR）、豆甾醇（Stigmasterol）等。上述活性成分主要作用于IL、JUN、TIMP-2、IGF-1、AR等靶標，涉及PI3K/Akt、NF-κB、MAPK、成纖維細胞生長因子受體2（FGFR2）信號通路。

圖8 “成分——靶標——通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Figure 8“Compound-target-pathway”network

3 討論

白芷，性辛、溫，趨向升浮，具有解表散寒、祛風止痛、宣通鼻竅、消腫排膿的功效，《本草匯言》云：“上行頭目，下抵腸胃，中達肢體，遍通肌膚以至毛竅，向利泄邪氣?！爆F(xiàn)代藥理研究表明，白芷復方、中成藥確有消腫排膿、美白延緩皮膚衰老和軟化角質(zhì)層的作用，但目前對于其治療痤瘡的具體作用機制尚不明確。因此，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的原理和方法，探究白芷治療痤瘡的作用機制，為其痤瘡治療的臨床應(yīng)用提供證據(jù)支持，對其在臨床上進一步推廣使用具有重大意義，并且可為更高層次的研究奠定基礎(chǔ)。

本次研究所獲得的白芷治療痤瘡的主要活性成分包括歐前胡素、β-谷甾醇、異歐前胡素、珊瑚菜內(nèi)酯、豆甾醇等。白芷的主要有效成分之一即為香豆素類，截止目前共從白芷中分離得到55種香豆素類化合物。本次獲得的有效成分大多屬于香豆素類，如歐前胡素、別歐前胡素、白當歸腦、異珊瑚菜素等。

相關(guān)研究[10]表明，歐前胡素對細菌具有較強的抑制作用，并且隨著濃度的增大，抑菌效果更明顯，可起到抗感染的治療目的。異歐前胡素可以促進溶菌酶的生成，激活單核細胞，增加巨噬細胞的吞噬功能及抗原呈遞功能，達到消炎抗感染的效果[11]。Choi等[12]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇是通過減少一氧化氮（NO）的合成，抑制巨噬細胞白細胞介素（IL）-6活性，減少IL-1、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎性因子的分泌發(fā)揮抗炎作用。研究[13]表明，β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、降低膽固醇、抗腫瘤等功效。C型凝集素受體（CLR）在調(diào)節(jié)抗真菌寄生蟲感染、過敏反應(yīng)和腫瘤免疫中扮演重要角色[14]。β-豆甾醇能顯著降低炎癥因子IL-1β、IL-6、單核細胞超化蛋白1（MCP-1）和相關(guān)環(huán)氧合酶2（COX-2）[15]。白當歸腦作為治療呼吸道炎癥藥物的應(yīng)用前景廣闊，白當歸腦可以劑量相關(guān)地抑制IL-1β誘導人肺上皮A549細胞中的前列腺素E2（PGE2）的釋放[16]。珊瑚菜內(nèi)酯能對脂肪分解具有促進作用并對脂肪合成具有抑制效果，還參與抗脂質(zhì)過氧化、清除氧自由基、抗細胞凋亡等反應(yīng)[17]。別歐前胡素、新比克白芷內(nèi)酯、異珊瑚菜素等相關(guān)報道資料稀少，在此不作贅述。

本研究中的“成分——靶標”網(wǎng)絡(luò)、靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)體現(xiàn)了白芷治療痤瘡具有多靶點、多途徑的特點，作用機制復雜多樣。分子對接試驗結(jié)果提示白芷活性成分和治療痤瘡相關(guān)的核心靶標之間結(jié)合能力良好，提示本實驗的數(shù)據(jù)與結(jié)果較為可靠，具有較高的參考價值。

同時本研究發(fā)現(xiàn)，白芷最可能是通過IL、JUN、TIMP-2、IGF-1、AR這5個靶標來發(fā)揮其治療痤瘡的作用。IL主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，介導免疫反應(yīng)，可能參與了痤瘡炎癥級聯(lián)反應(yīng)的啟動過程，刺激血管內(nèi)皮細胞表達白細胞黏附分子，誘導內(nèi)皮細胞通過自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生IL-8、單核趨化因子1，還可刺激中性粒細胞釋放炎癥遞質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)[18]。JUN蛋白是轉(zhuǎn)錄激活蛋白1的組成成分，同時也是激活轉(zhuǎn)錄激活蛋白1（AP-1）的必需物質(zhì)。AP-1能夠調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）類表達，包括MMP1、MMP3。JUN蛋白水平的上升能激活更多的AP-1，提高金屬蛋白酶的活性，促進皮膚膠原蛋白降解，增加皮膚皺紋的形成，促進皮膚光老化，增加皮膚損害[19，20]。Guillemin等[21]使用敷料GBT013作用于糖尿病小鼠慢性創(chuàng)面模型，發(fā)現(xiàn)其能促進糖尿病創(chuàng)面的愈合，與抑制體外MMP-2酶活性，防止生長因子降解，促進細胞增殖有關(guān)。有研究[22]結(jié)果顯示，IGF-1可促進皮脂腺細胞皮脂分泌增多，同時皮脂分泌增多的皮脂腺細胞Sox9的表達也明顯增多，說明在皮脂腺細胞中IGF-1可以上調(diào)Sox9的表達引起痤瘡。AR普遍存在于正常人的毛囊和皮脂腺中。已有研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡的發(fā)生與毛囊皮脂腺單位AR水平或AR對正常血清水平的雄激素的敏感性呈正相關(guān)[23]。AR可能是通過增加皮脂腺的皮脂分泌，導致痤瘡的發(fā)生[24]，也可能是干擾IGF-1的活性，誘導皮脂腺細胞參與脂質(zhì)的合成[25]。

本研究結(jié)果表明，白芷治療痤瘡主要涉及PI3K/Akt、NF-κB、MAPK、FGFR2 信號通路。PI3K/Akt通路在皮膚愈合中扮演重要的角色，促進痤瘡潰破后愈合。通過PI3K/Akt通路可以調(diào)節(jié)細胞凋亡來維持參與皮膚損傷愈合過程的細胞數(shù)量的穩(wěn)定[26]。研究[27]發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/Akt信號通路的表達可以抑制促炎因子的釋放來抑制炎癥的發(fā)生，減少痤瘡潰破后并發(fā)感染。有研究表明FGFR2通路可能參與痤瘡的發(fā)病過程，F(xiàn)GFR2通路參與皮膚附屬物的形成，調(diào)控毛囊皮脂腺穩(wěn)態(tài)，在皮脂腺的生成和增殖中起重要作用。過度刺激FGFR2信號并增加IL-1α的表達可以解釋Apert綜合征和Comedonicus痤瘡的發(fā)生。雄激素介導的FGFR2信號上調(diào)可能是痤瘡發(fā)病的起始信號[28]。通過MAPK信號通路激活p38 MAPK，從而促進巨噬單核細胞產(chǎn)生IL-1α、IL-6等因子，在炎癥反應(yīng)中作用重大，其中IL-1α能夠促進毛囊皮脂腺的角化，加重發(fā)病[29]。IL-6對炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答發(fā)揮重要影響，可誘導痤瘡發(fā)生炎癥反應(yīng)[30]。NF-κB為經(jīng)典炎癥通路，通過NF-κB通路可以激活多種炎癥反應(yīng)的發(fā)生和促進單核巨噬細胞生成多種炎癥因子。抑制NF-κB通路的激活可以抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，減輕癥狀，減少患者痛苦[31]。

本研究結(jié)果針對白芷治療痤瘡過程中的抗炎作用進行了進一步的機制探討，表明其治療過程涉及了多個活性成分、作用靶標及信號通路，其作用機制復雜多樣，并非僅通過單個成分、作用單個靶標或調(diào)控單條通路發(fā)揮作用，與中藥治療疾病的多靶點特點相吻合。分子對接結(jié)果亦驗證了本研究結(jié)果的可靠性，網(wǎng)絡(luò)分析所得的結(jié)果也與現(xiàn)有研究結(jié)果相符。但本研究結(jié)果只是一種理論上的分子機制預(yù)測探討，仍需通過進一步實驗來驗證藥物作用的具體機制及臨床實踐以發(fā)掘更多的應(yīng)用價值。