張志堅(jiān)， 楊兆麗， 謝丹娥， 劉澎， 張加頌， 宋健平

（1.廣東新南方青蒿藥業(yè)股份有限公司，廣東梅州 514300；2.廣東新南方青蒿科技有限公司，廣東梅州 514300；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405）

青蒿素哌喹片為青蒿素和哌喹組成的復(fù)方制劑，用于治療惡性瘧、間日瘧和三日瘧。該藥問(wèn)世于2006年，屬于國(guó)家一類新藥，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，是廣東新南方青蒿藥業(yè)股份有限公司獨(dú)家生產(chǎn)品種。青蒿素哌喹片原標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH08022006，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》（二部）“青蒿素哌喹片”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)[1]，采用高效液相色譜（HPLC）法檢查有關(guān)物質(zhì)，但該法未能將哌喹與被檢成分完全分離，靈敏度和專屬性較差。因此，為嚴(yán)格控制藥品質(zhì)量，本單位決定優(yōu)化質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提高青蒿素有關(guān)物質(zhì)的靈敏度、專屬性和可靠性，本課題組參考2015年版《中國(guó)藥典》、《國(guó)際藥典》第3版[2]中“青蒿素”及其他文獻(xiàn)[3-6]中有關(guān)青蒿類有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，研究HPLC法測(cè)定青蒿素哌喹片中青蒿素有關(guān)物質(zhì)的方法，并建立青蒿素有關(guān)物質(zhì)限度?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器島津LC-20A高效液相色譜儀。賽默飛Ultimate 3000高效液相色譜儀。色譜柱：YMCTriart C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；THERMOHypersil GOLD 柱（4.6 mm ×250 mm， 5 μm）；Welch-Xtimate柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。XP204S型萬(wàn)分之一分析天平、XS205DV型十萬(wàn)分之一分析天平（美國(guó)梅特勒——托利多有限公司）。

1.2試藥青蒿素哌喹片，廣東新南方青蒿藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20141001、20141002、20141003；青蒿素，廣東新南方青蒿藥業(yè)有限公司，批號(hào)：Y13120001；哌喹，廣東新南方青蒿藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20161030；雜質(zhì)A（青蒿烯），Toronto Research Chemicals，批號(hào)：9-MMH-173-1；雜 質(zhì) B（9-epi-Artemisinin）， Toronto Research Chemicals，批號(hào)：2-NKM-68-8；雜質(zhì)I[7-氯-4-（1-哌嗪基）喹啉]，中國(guó)藥品檢定研究院，批號(hào)：101339-201501；雜質(zhì)II（7-氯-4-羥基喹啉），中國(guó)藥品檢定研究院，批號(hào)：101340-201501；雜質(zhì)Ⅲ[1，4-二（7-氯喹啉-4-基）哌嗪]，中國(guó)藥品檢定研究院，批號(hào)：101341-201501；甲醇、乙腈均為色譜級(jí)（上海安譜公司）；水為超純水；三氯乙酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜條件：色譜柱為YMC-Triart C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.01%三氯乙酸（50∶50）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為20 μL；青蒿素峰與雜質(zhì)A峰的分離度應(yīng)大于4.0，相鄰色譜峰間分離度應(yīng)大于1.5。系統(tǒng)適用性溶液配制：分別精密稱取青蒿素原料及其雜質(zhì)A對(duì)照品、雜質(zhì)B對(duì)照品適量，用乙腈溶解稀釋，制成含青蒿素5 mg/mL、雜質(zhì)A 7.5 μg/mL、雜質(zhì)B 15 μg/mL的系統(tǒng)適用性溶液。

2.2測(cè)定方法取青蒿素哌喹片細(xì)粉適量（約相當(dāng)于青蒿素50 mg），加乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中約含青蒿素5 mg的溶液，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。精密量取上述溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的1.5倍。

2.3專屬性試驗(yàn)

2.3.1 雜質(zhì)定位與分離試驗(yàn) 按處方比例配制供試品溶液，青蒿素及其雜質(zhì)A、B對(duì)照品溶液，哌喹及其雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對(duì)照品溶液，不含青蒿素的陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，各雜質(zhì)與主峰、雜質(zhì)與雜質(zhì)間分離度均達(dá)到要求，陰性不干擾測(cè)定。其中5.7 min處色譜峰為未知雜質(zhì)峰1，因其含量小于0.1%，故不需要對(duì)其進(jìn)行鑒定研究。6.7 min處色譜峰為溶劑雜質(zhì)峰，在空白溶劑試驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)過(guò)。雜質(zhì)A峰、雜質(zhì)B峰的分離度為2.43，雜質(zhì)B峰與青蒿素峰的分離度為3.56，均達(dá)到完全分離。色譜圖見(jiàn)圖1～3。

2.3.2 強(qiáng)制降解試驗(yàn) 取陰性（空白輔料+哌喹）、哌喹原料、青蒿素原料、按處方比例配制的供試品適量（約相當(dāng)于青蒿素50 mg）置10 mL量瓶中，加入0.5 mol·L-1HCL溶液1 mL，室溫放置5 min后，加入0.5 mol·L-1NaOH溶液1 mL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為酸破壞樣品。取陰性（空白輔料+哌喹）、哌喹原料、青蒿素原料、按處方比例配制的供試品適量（約相當(dāng)于青蒿素50 mg）置10 mL量瓶中，加入0.5 mol·L-1NaOH溶液1 mL，室溫放置5 min后，加入0.5 mol·L-1HCL溶液1 mL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為堿破壞樣品。取陰性（空白輔料+哌喹）、哌喹原料、青蒿素原料、按處方比例配制的供試品適量（約相當(dāng)于青蒿素50 mg）置10 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)30%過(guò)氧化氫2 mL，室溫放置3 h后，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為氧化破壞樣品。取陰性（空白輔料+哌喹）、哌喹原料、青蒿素原料、按處方比例配制的供試品適量（約相當(dāng)于青蒿素50 mg）置10 mL量瓶中，加水2 mL后，90℃水浴2 h，放冷至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為水溶液高溫破壞樣品。樣品置105℃干燥3 h后，取陰性（空白輔料+哌喹）、哌喹原料、青蒿素原料、按處方比例配制的供試品適量（約相當(dāng)于青蒿素50 mg）置10 mL量瓶中，加乙腈適量超聲溶解后，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為高溫破壞樣品。樣品在強(qiáng)光（照度為4 500±500 lx）下照射11 d后，取陰性（空白輔料+哌喹）、哌喹原料、青蒿素原料、按處方比例配制的供試品適量（約相當(dāng)于青蒿素50 mg）置10 mL量瓶中，加乙腈適量超聲溶解后，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為光照破壞樣品。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果顯示：各強(qiáng)制降解條件下空白溶液和空白輔料對(duì)本品制劑和原料藥有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)均無(wú)干擾；各強(qiáng)制降解條件下原料藥供試品溶液中主峰與各雜質(zhì)峰、各主要雜質(zhì)峰之間均能有效分離；各強(qiáng)制降解條件下制劑供試品溶液中主峰與各雜質(zhì)峰、各主要雜質(zhì)峰之間均能有效分離。酸、堿、氧化、水溶液高溫、高溫及強(qiáng)光降解條件下，青蒿素原料供試品溶液的物料平衡指數(shù)分別為100.4%、100.8%、100.1%、100.0%、101.9%、100.1%，制劑供試品溶液的物料平衡指數(shù)分別為97.8%、90.2%、99.0%、97.7%、99.4%、97.4%，青蒿素+陰性供試品溶液的物料平衡指數(shù)分別為100.6%、90.8%、98.8%、95.0%、103.7%、102.1%，均在90.0%～110.0%之間。表明該方法對(duì)各主要降解雜質(zhì)均能較好檢出，該法能有效地檢出各破壞試驗(yàn)產(chǎn)生的雜質(zhì)，且各雜質(zhì)峰均能與主峰達(dá)到基線分離，專屬性較好。

2.3.3 色譜峰歸屬 方法同“2.3.2”項(xiàng)下強(qiáng)制降解試驗(yàn)。根據(jù)降解試驗(yàn)結(jié)果，酸、堿、氧化、水溶液高溫、高溫及強(qiáng)光降解條件下青蒿素分別在5.497、5.510、5.043、5.500、16.410、5.703 min保留時(shí)間之后產(chǎn)生降解產(chǎn)物，說(shuō)明青蒿素有關(guān)物質(zhì)均在5 min之后產(chǎn)生。而哌喹在上述降解條件下在3～5 min之間均有降解產(chǎn)物產(chǎn)生。因空白輔料中哌喹為近期生產(chǎn)批次，不能完全模擬當(dāng)時(shí)生產(chǎn)所用的空白輔料，在4 min左右的色譜峰無(wú)法解釋，但從降解試驗(yàn)光譜圖分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)，判斷是哌喹的降解產(chǎn)物，而哌喹有關(guān)物質(zhì)的研究在哌喹色譜條件下分析，在此條件下不再研究。為保證青蒿素有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的準(zhǔn)確性，減少哌喹及其輔料的干擾，我們確定青蒿素有關(guān)物質(zhì)的積分起始時(shí)間為4.5 min。

圖1 系統(tǒng)適用性色譜圖Figure 1 HPLC chromatogram of system suitability

1：溶劑雜質(zhì)；2：雜質(zhì)A；3：雜質(zhì)B；4：青蒿素

圖3 雜質(zhì)定位與分離試驗(yàn)色譜圖（2）Figure 3 HPLC chromatogram of impurity location and separation test（2）

2.4檢測(cè)限與定量限分別精密量取“2.3.1”項(xiàng)下青蒿素及其雜質(zhì)A、B對(duì)照品溶液適量，用乙腈逐步稀釋至各樣品主峰信噪比為3∶1和10∶1，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。青蒿素的定量限和檢出限分別為15、5 μg/mL，雜質(zhì)A的定量限和檢出限分別為0.25、0.075 μg/mL，雜質(zhì)B的定量限和檢出限分別為10、3 μg/mL。雜質(zhì)A、B的最低檢測(cè)限濃度均低于該雜質(zhì)的報(bào)告限度濃度，反映該分析方法的靈敏度符合要求。

2.5線性關(guān)系及范圍以雜質(zhì)限度為100%，從定量限開始至雜質(zhì)限度的200%～300%，分別取8個(gè)點(diǎn)，以濃度橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸分析。分別精密稱量青蒿素及其雜質(zhì)A、B對(duì)照品適量，用乙腈溶解并逐步稀釋至青蒿素濃度依次為 15、20、25、30、35、40、45、50 μg/mL，雜質(zhì) A 濃度依次為 0.25、1.0、5.0、10.0、15、20、25、30 μg/mL，雜質(zhì)B濃度依次為10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45 μg/mL。 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，得到回歸方程。青蒿素：Y=0.014 1 X+0.007 4，r=0.999 4；雜質(zhì)A：Y=0.5164 X+0.045，r=0.999 9；雜質(zhì) B：Y=0.015 7 X-0.014 3，r=0.998 1。各線性方程的相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.990，Y軸截距均在100%響應(yīng)值的25%以內(nèi)，響應(yīng)因子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于10%。結(jié)果表明青蒿素濃度在15～51 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，雜質(zhì)A濃度在0.3～30 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，雜質(zhì)B濃度在10～46 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

通過(guò)線性斜率比值計(jì)算得，雜質(zhì)A校正因子為0.027，雜質(zhì)B校正因子為0.90。參照青蒿素原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（國(guó)際藥典和中國(guó)藥典），確定雜質(zhì)A校正因子為0.027，又因雜質(zhì)B校正因子在0.9～1.1范圍內(nèi)，確定雜質(zhì)B校正因子為1.00。

2.6加樣回收率試驗(yàn)分別精密稱取青蒿素哌喹片細(xì)粉適量加乙腈適量制成約相當(dāng)于含青蒿素20 mg/mL的溶液，過(guò)濾后，精密量取2.5 mL，12份，分別置10 mL量瓶中。再分別精密量取對(duì)照品貯備液（含雜質(zhì)A 15 μg/mL，雜質(zhì)B 30 μg/mL）2.5、3.3、5、7.5 mL，用乙腈稀釋至刻度，即得各濃度供試品溶液。濃度分別為供試品總量限度的50%、66%、100%、150%，即雜質(zhì)A約相當(dāng)于主成分的0.075%、0.100%、0.150%、0.225%，雜質(zhì)B約相當(dāng)于主成分的0.15%、0.20%（為雜質(zhì)B定量限）、0.30%、0.45%，每個(gè)濃度平行制備3份平行樣。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。雜質(zhì)A的加樣回收率（n=12）為96.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，sR）為1.04%；雜質(zhì)B的加樣回收率（n=9）為85.9%，sR為3.21%。各濃度平均回收率均在80%～120%間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%內(nèi)。

2.7精密度試驗(yàn)按“2.1”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液和色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和青蒿素峰面積的sR為0.14%、3.39%、0.02%，符合精密度實(shí)驗(yàn)要求。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)分別精密稱取青蒿素哌喹片細(xì)粉適量（約相當(dāng)于青蒿素50 mg），置10 mL量瓶中，精密移入0.1 mg/mL的雜質(zhì)B對(duì)照品貯備液1.5 mL，加乙腈適量溶解，定容搖勻?yàn)V過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。平行制備6份。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算雜質(zhì)A、雜質(zhì)B含量的sR為3.23%、4.18%，符合重復(fù)性實(shí)驗(yàn)要求。

2.9溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)按“2.1”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液和色譜條件，分別于0、4、8、12、24、48 h測(cè)定，記錄色譜圖。48 h內(nèi)樣品溶液中雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和青蒿素峰面積的sR為0.41%（不超過(guò)10%）、3.68%（不超過(guò)10%）、0.64%（不超過(guò)2%），各峰面積均未出現(xiàn)顯著性變化。結(jié)果符合驗(yàn)證要求，表明溶液在48 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.10耐用性試驗(yàn)分別考察了不同色譜柱[YMCTriart C18（2）柱 、 THERMO-Hypersil GOLD 柱 ，Welch-Xtimate柱]，乙腈-0.01%三氯乙酸流動(dòng)相不同體積比（45∶55、50∶50、55∶45），不同流速（0.9、1.0、1.1 mL/min），不同檢測(cè)波長(zhǎng)（208、210、212 nm），不同三氯乙酸濃度（0.01%、0.05%、0.1%），不同柱溫（33、35、37℃），不同品牌濾膜（津騰、安譜、進(jìn)口某品牌）下青蒿素與雜質(zhì)A、雜質(zhì)B峰之間的分離度。結(jié)果均分離良好，對(duì)本品有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)沒(méi)有顯著影響。

2.11 3批樣品測(cè)定取3批樣品（批號(hào)：20141001、20141002、20141003），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液與對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3批樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of related substances in 3 batches of samples

3 討論

由原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)，雜質(zhì)B未檢出，反映原方法靈敏度差，但總雜含量2%，又與其青蒿素含量99%不一致，反映原方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性差。由此可見(jiàn)，原方法檢測(cè)雜質(zhì)B檢測(cè)靈敏度低，檢測(cè)結(jié)果雜質(zhì)A、未知單雜和總雜虛高，與實(shí)際情況不符。

新修訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法采用乙腈-0.01%三氯乙酸系統(tǒng)的流動(dòng)相，能將青蒿素峰、哌喹峰及其各雜質(zhì)峰有效分開，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高。但三氯乙酸濃度不宜高，我們比較了0.01%、0.05%、0.1%3個(gè)濃度，發(fā)現(xiàn)酸濃度越高，對(duì)青蒿素和各雜質(zhì)峰的峰面積影響較大，峰降解越嚴(yán)重。

從破壞試驗(yàn)看，各破壞條件下均降解產(chǎn)生未知雜質(zhì)，但雜質(zhì)A峰面積沒(méi)有變化，較穩(wěn)定。堿破壞條件和水溶液高溫破壞條件下，雜質(zhì)B峰面積增加明顯，穩(wěn)定性考察需重點(diǎn)關(guān)注。

耐用性試驗(yàn)顯示，不同色譜柱對(duì)各峰的相對(duì)保留時(shí)間不一致，對(duì)雜質(zhì)B的含量計(jì)算差異也大。相同品牌色譜柱對(duì)各峰的相對(duì)保留時(shí)間一致，雜質(zhì)含量結(jié)果一致。建議使用該方法應(yīng)注意流動(dòng)相三氯乙酸的濃度配制要精準(zhǔn)，以及要求使用固定品牌的色譜柱。

青蒿素原料中雜質(zhì)B的含量較低，部分原料中雜質(zhì)B幾乎不能檢出，參照《國(guó)際藥典》中青蒿素原料中有關(guān)物質(zhì)的方法，在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中規(guī)定了青蒿素峰與雜質(zhì)A峰的分離度應(yīng)大于4.0，并增加了相鄰色譜峰間分離度應(yīng)大于1.5。

本研究對(duì)精密度試驗(yàn)的樣品分別用外標(biāo)法和自身對(duì)照法計(jì)算并進(jìn)行比較，雜質(zhì)A用外標(biāo)法計(jì)算含量為0.03%，sR為3.41%，用自身對(duì)照法計(jì)算含量為0.03%，sR為1.90%，合并兩組數(shù)據(jù)含量為0.03%，sR為4.71%，表明兩種方法計(jì)算結(jié)果一致。雜質(zhì)B用外標(biāo)法計(jì)算含量為0.31%，sR為3.03%，用自身對(duì)照法計(jì)算含量為0.39%，sR為4.15%，合并兩組數(shù)據(jù)含量為0.35%，sR為12.70%，因雜質(zhì)B校正因子為0.90（在0.9～1.1范圍內(nèi)），但以自身對(duì)照法計(jì)算時(shí)雜質(zhì)B校正因子按1.00計(jì)算，又因用供試品溶液對(duì)照峰面積直接計(jì)算，故2種計(jì)算方法會(huì)有一定差異，但在允許范圍內(nèi)。參照《國(guó)際藥典》青蒿素有關(guān)物質(zhì)方法和2015年版《中國(guó)藥典》（二部）青蒿素哌喹片中青蒿素有關(guān)物質(zhì)方法，確定采用自身對(duì)照法計(jì)算，雜質(zhì)A需加校正因子。