朱毅偉,陳曉雯,趙立偉,朱傳合*

響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助VC/H2O2山楂果膠改性研究

朱毅偉1,陳曉雯1,趙立偉2,朱傳合1*

1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)和工程學(xué)院, 山東 泰安 271018 2. 江蘇派樂滋食品有限公司, 江蘇 徐州 221000

果膠是一種酸性多糖，被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)及其它行業(yè)。果膠的生物活性與其分子量和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本研究以實(shí)驗(yàn)室自制山楂果膠為原料，采用超聲輔助VC/H2O2改性山楂果膠，以固有粘度和還原糖含量為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改性工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為：H2O2濃度66 mmol/L、VC濃度21 mmol/L、溫度30 ℃、超聲次數(shù)207次、超聲振幅31%，在此條件下，果膠的還原糖含量為52.22±0.68%，與預(yù)測(cè)值基本一致，說明該模型具有可靠性。

山楂果膠; 改性; 超聲輔助VC/H2O2

果膠是一種存在于植物初生細(xì)胞壁和胞間層的大分子多糖[1]，因其具有凝膠、增稠、乳化等功能性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，另外，果膠還可以用于保健食品和藥品[2]。山楂中的果膠含量達(dá)6.4%，居所有水果之首[3]。研究顯示，山楂果膠及其寡糖具有抑制光氧化損傷、抗氧化、抑菌等作用[4-6]。

果膠的生物活性與其分子量密切相關(guān)，在一定的分子量范圍內(nèi)，分子量越低，果膠的生物活性越高[7,8]。實(shí)驗(yàn)室前期制備得到的山楂果膠其分子量大、粘度高、水溶性差，限制了其生物活性的發(fā)揮。因此，選擇適宜的改性方法可以降低果膠的分子量、改善其水溶性，從而具有更好的生物活性[9]。然而，改性果膠的研究主要集中在柑橘果膠方面[2,9]，對(duì)山楂果膠改性方面的研究報(bào)道較少。目前，果膠改性的方法主要包括酸/堿法、氧化法、酶法和超聲等物理改性法[10]。在改性過程中，可以將多種改性方法聯(lián)合使用，如超聲輔助VC/H2O2改性，H2O2在酸性環(huán)境中，可以產(chǎn)生高活性的羥自由基（·OH），促進(jìn)多糖氧化降解，另外，F(xiàn)e2+、VC等可以作為催化劑，提高反應(yīng)速率[11]。超聲波對(duì)VC/H2O2改性具有協(xié)同作用，其空化效應(yīng)能夠引起果膠多糖等大分子物質(zhì)的化學(xué)鍵斷裂、自由基氧化等反應(yīng)[12]，可以提高反應(yīng)速率，降低反應(yīng)時(shí)間以及H2O2用量。因此，本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化超聲輔助VC/H2O2改性山楂果膠的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂果膠（實(shí)驗(yàn)室自提）；VC、30% H2O2、亞硫酸氫鈉、DNS、氯化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PB153-S分析天平，METTLER TOLEDO；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī)，德國(guó)CHRIST。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1超聲輔助VC/H2O2改性山楂果膠的工藝優(yōu)化向山楂果膠中加入一定量的H2O2和VC，用去離子水定容，配成濃度為0.5%的山楂果膠溶液，取10 mL果膠溶液進(jìn)行超聲處理，超聲波頻率為20 kHz，探頭直徑6 mm，探頭沒入液面下1 cm，脈沖時(shí)間為3 s，間隔5 s。溫度為30 ℃，改變超聲次數(shù)（脈沖次數(shù)）和超聲振幅。加入NaHSO3溶液（0.2 mol/L）終止反應(yīng)，離心，濃縮，凍干，備用。

1.3.1.1 H2O2濃度對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響在溫度30 ℃、VC濃度10 mmol/L、超聲次數(shù)100次、超聲振幅30%的條件下，研究H2O2濃度0、20、40、60、80、100 mmol/L對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響。

1.3.1.2 VC濃度對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響在溫度30 ℃、H2O2濃度60 mmol/L、超聲次數(shù)100次、超聲振幅30%、VC濃度0、5、10、15、20、25 mmol/L的條件下處理果膠，測(cè)定其固有粘度和還原糖含量。

1.3.1.3 超聲次數(shù)對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響在溫度30 ℃、H2O2濃度60 mmol/L、VC濃度20 mmol/L、超聲振幅30%、超聲次數(shù)10、20、40、100、200、300次的條件下，以果膠固有粘度和還原糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳條件。

1.3.1.4 超聲振幅對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響在H2O2濃度60 mmol/L、VC濃度20 mmol/L、溫度30 ℃、超聲次數(shù)200次的條件下，研究超聲振幅0、20、30、40、50%對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響。

1.3.1.5 響應(yīng)面優(yōu)化在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以還原糖含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取H2O2濃度、VC濃度、超聲次數(shù)和超聲振幅四個(gè)因素設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，其因子編碼及水平見表1。

表1 BB實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3.2 山楂果膠固有粘度的測(cè)定在室溫條件下，使用奧氏粘度計(jì)測(cè)定固有粘度（[]）。將果膠溶解于0.1mol/L NaCl溶液中，配置成濃度為0.1 mg/mL的果膠溶液。取10 mL果膠溶液于粘度計(jì)中并記錄溶液流經(jīng)上下刻度的時(shí)間（t）。用0.1mol/L NaCl溶液代替樣品溶液，重復(fù)上述操作，記錄時(shí)間（0）。固有粘度的計(jì)算公式如下[13]：

式中，t和0分別為樣品溶液和0.1 mol/L NaCl溶液流經(jīng)上下刻度的時(shí)間；為樣品溶液的濃度；η和η分別為增比粘度和相對(duì)粘度。

1.3.3山楂果膠還原糖含量的測(cè)定還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸法進(jìn)行測(cè)定[14]。以D-Gal A為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為=1.4051-0.1176（2=0.9990）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 H2O2濃度對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響由圖1可知，隨著H2O2濃度的增加，固有粘度顯著降低（<0.05），在60 mmol/L后趨于平穩(wěn)；還原糖含量隨著H2O2濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在60 mmol/L時(shí)還原糖含量最高。高濃度的H2O2反而會(huì)抑制果膠的降解，因此，選擇H2O2濃度為60 mmol/L進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖 1 H2O2濃度對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響

Fig.1 Effect of H2O2concentration on intrinsic viscosity and reducing sugar content of pectin

2.1.2 VC濃度對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響圖2表明隨著VC濃度的增加，固有粘度顯著降低（<0.05），在VC濃度達(dá)到10 mmol/L后對(duì)固有粘度的影響不顯著（?0.05）；還原糖含量隨著VC濃度的增加而增加（<0.05），在VC濃度為20 mmol/L時(shí)達(dá)到最大，綜合考慮兩個(gè)指標(biāo)，確定VC濃度為20 mmol/L。

圖2 VC濃度對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響

Fig.2 Effect of VC concentration on intrinsic viscosity and reducing sugar content of pectin

2.1.3 超聲次數(shù)對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響通過圖3可知，隨著超聲次數(shù)的增加，固有粘度顯著降低（<0.05），在超聲次數(shù)達(dá)到100次后趨于平穩(wěn)；還原糖含量隨著超聲次數(shù)的增加而增加（<0.05），在超聲次數(shù)為200次后變化不顯著（?0.05），分析原因可能是由于加入樣品中的H2O2和VC濃度有限，在達(dá)到一定超聲次數(shù)后，繼續(xù)增加超聲次數(shù)并沒有改變產(chǎn)生的自由基數(shù)量，所以反應(yīng)效果也逐漸趨于平穩(wěn)。綜合考慮固有粘度和還原糖含量，選擇超聲次數(shù)為200次進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 超聲次數(shù)對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響

Fig.3 Effect of ultrasonic timeson intrinsic viscosity and reducing sugar content of pectin

2.1.4 超聲振幅對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響由圖4可以看出，隨著超聲振幅的增加，固有粘度顯著降低（<0.05），在超聲振幅為30%后趨于平穩(wěn)；還原糖含量在超聲振幅30%時(shí)最高，繼續(xù)提高超聲振幅，還原糖含量略有降低（?0.05）?？梢钥闯?，超聲對(duì)反應(yīng)體系具有催化作用，能夠顯著提高反應(yīng)速率。考慮能耗等方面，選擇超聲振幅為30%進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖4 超聲振幅對(duì)果膠固有粘度和還原糖含量的影響

Fig.4 Effect of ultrasonic amplitude on intrinsic viscosity and reducing sugar content of pectin

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)BB實(shí)驗(yàn)，用自變量A、B、C、D表示H2O2濃度（mmol/L）、VC濃度（mmol/L）、超聲次數(shù)（次）、超聲振幅（%）四個(gè)因素，以還原糖含量為響應(yīng)值（Y）。利用軟件Design Expert8.0.6對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸模型參數(shù)和方差分析，結(jié)果見表2和表3。

表2 BB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

Table 3 Variance analysis of regression model

以還原糖含量為響應(yīng)值，建立二次響應(yīng)面模型，擬合得方程為：

（還原糖含量）=52.68+0.68+3.72-0.11+0.17+1.34-1.27+1.23-0.012+2.94-0.17-2.172-8.102-3.362-6.522。

根據(jù)表2可知，響應(yīng)面回歸模型極顯著（<0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（=0.4753>0.05），相關(guān)系數(shù)（2）為99.71 %，表明該回歸模型擬合度較高，在各因素的研究范圍內(nèi)可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)際值。此外，較低的變異系數(shù)（C.V.=0.93）也說明了回歸模型的可靠性高，誤差較小。根據(jù)值和值可知，各因素對(duì)還原糖含量的影響大小依次為：VC濃度>H2O2濃度>超聲振幅>超聲次數(shù)。其中，VC濃度和H2O2濃度對(duì)還原糖含量的影響顯著（<0.001），而超聲振幅和超聲次數(shù)對(duì)還原糖含量的影響不顯著（>0.05）；二次項(xiàng)、、、、2、2、2和2影響顯著（<0.001）。

將回歸模型中的任意兩個(gè)因素固定在零水平，獲得其余兩個(gè)因素相互作用對(duì)還原糖含量的影響，其響應(yīng)面圖如圖5所示。

圖5 響應(yīng)曲面圖

Fig.5 Response surface plots

從圖5a和圖5f中響應(yīng)面的陡峭程度可以看出，H2O2濃度和VC濃度對(duì)還原糖含量的影響顯著，從圖5b和圖5d可以看出，VC濃度對(duì)還原糖含量的影響要大于H2O2濃度。同樣的，從圖5c和圖5e可以得到類似的結(jié)果。通過比較圖5b和圖5c（或圖5d和圖5e）可知，超聲振幅比超聲次數(shù)對(duì)還原糖含量的影響大。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)回歸模型得到最佳改性條件為：溫度30 ℃、H2O2濃度65.73 mmol/L、VC濃度21.36 mmol/L、超聲次數(shù)206.67次、超聲振幅31.01%，在此條件下，預(yù)測(cè)還原糖含量為53.29%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的可操作性，將實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定為：溫度30 ℃、H2O2濃度66 mmol/L、VC濃度21 mmol/L、超聲次數(shù)207次、超聲振幅31%。在此條件下重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，還原糖含量為52.22±0.68%，與預(yù)測(cè)值（53.29%）偏差不大（>0.05）。這表明該模型是可靠的。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了山楂果膠的改性工藝。由響應(yīng)面分析結(jié)果可知各因素對(duì)還原糖含量的影響大小依次為：VC濃度>H2O2濃度>超聲振幅>超聲次數(shù)，其中VC濃度和H2O2濃度對(duì)還原糖含量的影響顯著。綜合回歸模型和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終確定超聲輔助VC/H2O2改性山楂果膠的最佳條件為：H2O2濃度66 mmol/L、VC濃度21 mmol/L、溫度30 ℃、超聲次數(shù)207次、超聲振幅31%，在此條件下進(jìn)行三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得還原糖含量的平均值為52.22±0.68%，與理論預(yù)測(cè)值基本一致（>0.05），說明回歸模型的可靠性高。研究表明超聲輔助VC/H2O2改性山楂果膠是一種切實(shí)可行的方法，能夠降解果膠，實(shí)現(xiàn)果膠高效修飾。

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115-119,114

Study on the Hawthorn Pectin Modified by which Response Surface Optimized Ultrasonic with VC/H2O2

ZHU Yi-wei1, CHEN Xiao-wen1, ZHAO Li-wei2, ZHU Chuan-he1*

1.271018,2.221000,

Pectin is an acidic polysaccharide, which is widely used in food industry and other industrial fields. The biological activity of pectin is closely related to its molecular weight and structure. Using the hawthorn pectin in the laboratory as raw material, we adopted ultrasound-assisted VC/H2O2to modify hawthorn pectin, and optimized the modification process by single factor experiment and response surface experiment with the inherent viscosity and reducing sugar content as indicators. The results show that the best process parameters were: H2O2concentration 66 mmol/L, VC concentration 21 mmol/L, temperature 30 °C, pulse number 207 and ultrasonic amplitude 31%. Under these conditions, the reducing sugar content of pectin was 52.22±0.68%, which was basically consistent with the predicted value. It shows that the model has reliability.

Hawthorn pectin; modification; ultrasonic with VC/H2O2

TS201.7

A

1000-2324(2019)04-0686-06

2019-04-04

2019-04-21

山東省2017年度農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目;山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(GG201703080015);山東省“雙一流”獎(jiǎng)補(bǔ)資金資助(SYT2017XTTD04);泰安市大學(xué)生科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃

朱毅偉(1998-),女,在校本科生,專業(yè)方向:食品質(zhì)量與安全(中英). E-mail:1260193690@qq.com

Author for correspondence. E-mail:chhzhu@sdau.edu.cn