楊慧敏，吳良如，楊金來，潘雁紅，鄭友苗

（1.國家林業(yè)和草原局竹子研究開發(fā)中心，浙江 杭州310012；2.浙江省竹子高效加工重點實驗室，浙江 杭州310012）

勃氏甜龍竹（Dendrocalamus brandisii（Munro）Kurz.），系統(tǒng)分類為竹亞科牡竹屬，是優(yōu)質(zhì)的大型叢生筍材兩用竹。主要分布于亞洲熱帶和南亞熱帶的緬甸、老撾、越南、泰國北部和中國云南省，廣東省、福建省有栽培［1］。勃氏甜龍竹的正常發(fā)筍期6-10月，筍重1～3 kg，筍體潔白粗壯，筍肉鮮嫩，甘甜爽脆，豐產(chǎn)性好，年產(chǎn)可達30 t·hm-2以上［1］。楊宇明等［2］測定每100 g竹筍含粗蛋白1.95 g。裴佳龍等［3］對云南4個不同地理種源的勃氏甜龍竹每100 g竹筍的粗蛋白進行測定，含量分別是隴川2.13 g，石屏2.11 g，思茅1.89 g，滄源1.20 g；隴川種源的蛋白含量最高，石屏和思茅種源的蛋白含量差異不顯著，而滄源種源的蛋白質(zhì)含量最低。

蛋白質(zhì)是基因表達的最終產(chǎn)物，最為直接反映細(xì)胞代謝和表型，可用于補充基因組和基因表達研究［4］。雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）是從細(xì)胞、組織或其他生物樣品中提取的蛋白混合物最有力和應(yīng)用最廣泛的實驗技術(shù)。雙向凝膠電泳圖譜中蛋白點的數(shù)量和質(zhì)量則直接反映了樣品中蛋白質(zhì)信息的完整性［5］，因此建立一套分辨率高和重復(fù)性好的雙向電泳體系是開展蛋白質(zhì)組研究的關(guān)鍵。

竹筍是從竹子根狀莖上萌發(fā)分化而成的膨大的芽和幼嫩的莖，常含有許多次生代謝產(chǎn)物，如酚類、甾醇類、多糖、鹽離子，同時也可能含有其他干擾物質(zhì)，如核酸、多糖、酚、脂類、醌等［6-7］，這就導(dǎo)致蛋白質(zhì)的提純非常困難，從而增加其蛋白雙向電泳的技術(shù)難度。因此，研究采用TCA／丙酮法和改良TCA-酚法提取其竹筍總蛋白，pH 3～10和pH 4～7的IPG膠條進行蛋白雙向電泳研究，以期建立勃氏甜龍竹筍蛋白的雙向電泳體系，并通過PDquest軟件分析，了解其蛋白的等電點和分子量的分布情況，為后續(xù)開展相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試竹筍 勃氏甜龍竹筍2018年7月20日采集自云南省普洱市思茅區(qū)南屏鎮(zhèn)曼歇壩村。

1.1.2 主要試劑及試劑盒

酚抽提液：0.7 M蔗糖，0.1 M KCl，0.5 M Tris-HCl（pH 7.5），50 mM EDTA，0.2%DTT）。

蛋白質(zhì)裂解液：尿素7 M，硫脲2 M，CHAPS（3-［（3-膽酰胺丙基）-二乙胺］-丙磺酸）4%，DTT（二硫蘇糖醇）65 m，Bio-Rad Ampholyte 0.5%，PMSF（苯甲基磺酰氟）1 mM。

膠條平衡緩沖液母液：尿素6 M，SDS 2%，Tris-HCl（1.5 M，pH 8.8）0.375 M，甘油20%。

封膠液：低熔點瓊脂糖0.5%，Tris 25 mM，甘氨酸192 mM，SDS 0.1%，溴酚藍0.001%。

ReadyStrip IPG Strip pH 3～10，24 cm、IPG Buffer pH 3～10、ReadyStrip IPG Strip pH 4～7，24 cm、IPG Buffer pH 4～7、2D Equilibration Buffer（貨號：SD6030）購自GE Healthcare公司。

改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒（貨號：C503041）和靈敏型蛋白質(zhì)快速染色試劑盒（貨號：C510039）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 分光光度儀（Evolution 200，賽默飛世爾科技）；IPGhor等電聚焦儀（GE Healthcare）：Ettan DALT電泳系統(tǒng)（GE Healthcare）；凝膠掃描儀（GE Healthcare）。

1.2 方法

1.2.1 竹筍總蛋白提取 將竹筍樣品放于研缽中，加液氮研磨粉碎，并在研磨過程中加入適量聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

TCA／丙酮法：將磨好的樣品粉末放入50 mL離心管中，加入預(yù)冷的10% 三氯乙酸（TCA）-丙酮溶液（含0.1% DTT和1mM PMSF），在-20℃冰箱中靜置過夜，4℃，12 000 rpm離心20 min，棄上清。在沉淀物中加入預(yù)冷的丙酮溶液（含0.1% DTT和1 mM PMSF），-20℃靜置2 h，4℃，15 000 rpm，離心20 min，棄上清，取沉淀，凍干30 min，即為總蛋白粉末。

改良TCA-酚法：將液氮研磨好的樣品粉末，按照1∶10的比例加入預(yù)冷的含10%TCA的丙酮，-20℃沉淀1 h。4℃，12 000 rpm離心15 min，棄上清，取沉淀，加入預(yù)冷的丙酮，-20℃沉淀1 h。重復(fù)以上步驟1次。4℃，12 000 rpm離心15 min，棄上清，取沉淀，真空冷凍干燥成粉末后加入等體積的酚-Tris-HCl（pH 7.5）飽和溶液，4℃下振蕩混勻30 min后6 800 rpm離心30 min，吸取酚上層，加入等體積的酚抽提液。重復(fù)以上步驟1次。吸取酚上層，加入5倍體積預(yù)冷的0.1 M醋酸銨-甲醇溶液，-20℃沉淀1 h。4℃，12 000 rpm離心30 min，棄上清，取沉淀。加入2倍體積預(yù)冷的甲醇清洗，輕微振蕩混合。4℃，12 000 rpm離心10 min，棄上清，取沉淀。重復(fù)以上步驟3次。丙酮代替甲醇再次重復(fù)以上步驟3次。4℃，12 000 rpm離心10 min，棄上清，取沉淀，凍干30 min，即為總蛋白粉末。

各取100μg蛋白質(zhì)粉末于2 mL離心管中，加入800μL蛋白質(zhì)裂解液，30℃水浴1 h，充分溶解后，25℃，12 000 rpm離心15 min，取上清；并再次離心，取上清，即為勃氏甜龍筍的總蛋白溶液。

1.2.2 竹筍蛋白濃度的測定 采用改良型Bradford法蛋白濃度測定試劑盒測定竹筍蛋白的濃度，具體步驟詳見其使用說明書。

1.2.3 雙向電泳

（1）等電聚焦電泳。選用24 cm、pH 3～10或pH 4～7 IPG預(yù)制干膠條，進行第一向的等電聚焦，蛋白上樣量為1 500μg。在50 V預(yù)電泳14 h后正式電泳，電泳參數(shù)見表1。

表1 電泳分析條件Tab.1 Conditions for electrophoretic analysis

（2）膠條平衡。將等電聚焦完成后的每根膠條加平衡液1（膠條平衡緩沖母液中加1% DTT）10 mL，搖床平衡15 min。清洗膠條，加入平衡母液2（膠條平衡緩沖母液中加2.5% IAA），搖床平衡15 min。

（3）SDS-PAGE凝膠電泳。將平衡后的膠條放入凝膠板中，加入封膠液，室溫靜置20 min后開始第二向的SDS-PAGE凝膠電泳。凝膠濃度為12%。預(yù)電泳參數(shù)設(shè)定為：70V，60 min，正式電泳參數(shù)設(shè)定為：300 V，至溴酚藍離膠下沿0.5 cm處停止；冷卻循環(huán)溫度設(shè)定為16℃。

（4）凝膠染色。電泳結(jié)束后，輕輕撬開玻璃，取出凝膠，用超純水沖洗凝膠，采用上海生工靈敏型蛋白質(zhì)快速染色試劑盒進行染色，具體步驟詳見其使用說明書。

（5）凝膠圖譜掃描。采用GE Healthcare凝膠掃描儀，300 dpi分辨率，對染色后的凝膠進行掃描。使用PDquest 8.0軟件對凝膠圖譜上的蛋白點進行檢定、匹配和編輯、數(shù)據(jù)分析和輸出，計算各蛋白點的等電點和相對分子質(zhì)量。

圖1 牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of BSA

2 結(jié)果與分析

2.1 2種方法提取竹筍總蛋白的定量結(jié)果

采用分光光度計，以超純水為空白對照，牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在595 nm處測定各不同濃度梯度的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線做線性回歸，得到的方程為：y＝0.029x-0.013，R2＝0.999。TCA／丙酮法提取的勃氏甜龍竹筍總蛋白平均吸光度為0.168，計算得到的其蛋白濃度為6.098 mg·mL-1；而改良TCA-酚法提取的總蛋白平均吸光度為0.159，計算得到其蛋白濃度為5.783 2 mg·mL-1?？梢?，TCA／丙酮法提取的總蛋白的得率要高于改良TCA-酚法。

2.2 2種方法提取竹筍總蛋白的雙向電泳結(jié)果

圖2分別為TCA／丙酮法和改良TCA-酚法提取的總蛋白的雙向電泳凝膠圖譜。經(jīng)PDquest 8.0軟件分析，TCA／丙酮法提取的總蛋白，共分離出約726個蛋白點；而改良TCA-酚法提取的總蛋白，共分離出約511個蛋白點?？梢?，TCA／丙酮法比改良TCA-酚法能提取更多的竹筍蛋白種類。

圖2 TCA／丙酮法和改良TCA-酚法提取的竹筍總蛋白的雙向電泳凝膠圖譜Fig.2 The two dimensional gel electrophoresis pattern of total protein of bamboo shoots extracted respectively by using TCA／acetone method and modified TCA-phenol method

圖3 TCA／丙酮法和改良TCA-酚法在不同等電點范圍的蛋白點數(shù)比較圖Fig.3 The comparison of protein spots of isoelectric point distribution between TCA／acetone method and modified TCA-phenol method

2.2.1 不同等電點范圍的蛋白點數(shù)的比較 圖3為TCA／丙酮法和改良TCA-酚法提取的竹筍蛋白在各不同等電點范圍內(nèi)的蛋白點數(shù)的比較圖。由圖3可見，TCA／丙酮法提取的蛋白點數(shù)在不同等電點范圍內(nèi)比改良TCA-酚法普遍都高，尤以酸性端更顯著；竹筍蛋白主要集中在pH 4～7，其中TCA／丙酮法占92.29%，改良TCA-酚法為90.41%，可見，勃氏甜龍竹筍以酸性蛋白為主。另外，改良TCA-酚法卻在堿性端pH 8～9范圍內(nèi)的蛋白點數(shù)高于TCA／丙酮法，其提取的堿性蛋白占總蛋白的8.21%，而TCA／丙酮法為5.09%，可見，改良TCA-酚法在堿性蛋白提取方面要優(yōu)于TCA／丙酮法。

2.2.2 不同相對分子質(zhì)量范圍的蛋白點數(shù)的比較 圖4為TCA／丙酮法和改良TCA-酚法提取的竹筍蛋白在各不同相對分子量范圍內(nèi)的蛋白點數(shù)的比較圖。由圖4可見，勃氏甜龍竹的筍蛋白在10～120 kDa范圍內(nèi)都有分布，并呈現(xiàn)3個峰，一個在10～40 kDa，一個在40～80 kDa，一個在80～120 kDa；竹筍蛋白主要集中在10～40 kDa范圍內(nèi)，其中TCA／丙酮法占58.95%，改良TCA-酚法為48.14%，可見，勃氏甜龍筍主要是以分子量低的蛋白為主。另外，TCA／丙酮法提取的蛋白在不同相對分子量范圍內(nèi)比改良TCA-酚法普遍都高，僅在70～80 kDa范圍內(nèi)略低于改良TAC-酚法，可見，TCA／丙酮法更適合于勃氏甜龍筍蛋白的提取。

2.3 不同p H膠條對蛋白雙向電泳效果的影響

為了進一步觀察竹筍總蛋白在雙向電泳圖譜上的分布情況，試驗分別采用24 cm，pH 3～10和pH 4～7的IPG預(yù)制干膠條對TCA／丙酮法提取的總蛋白進行雙向電泳，結(jié)果見圖5。經(jīng)PDquest 8.0軟件分析，pH 3～10膠條，共分離出約726個蛋白點；而pH 4～7膠條，共分離出約1 196個蛋白點。從圖中我們可以看出，勃氏甜龍竹的筍蛋白點大多分布在凝膠圖譜的酸性端，而在凝膠圖譜的堿性端分布的比較少。pH 3～10的膠條圖譜上的蛋白點數(shù)量少，絕大部分都集中在pH 4～7范圍內(nèi)。在pH 4～6間的中、高分子量的蛋白質(zhì)點分布非常密集，緊鄰甚至重疊在一起，沒有進行有效的分離。另外，圖譜的堿性端蛋白點相對較少，而且連成線條狀，沒有有效地分離開。而pH 4～7的膠條得到的雙向電泳圖譜上的蛋白點數(shù)量多，分離得比較開，蛋白點的分布也相對均勻，分離效果比較好，所以選用pH 4～7的膠條更合適。

圖4 TCA／丙酮法和改良TCA-酚法在不同相對分子質(zhì)量范圍的蛋白點數(shù)比較圖Fig.4 The comparsion of protein spots of relative molecular mass distribution between TCA／acetone method and modified TCA-phenol method

圖5 采用p H 3～10和pH 4～7膠條的竹筍總蛋白雙向電泳圖譜Fig.5 The two dimensional gel electrophoresis pattern of total protein of bamboo shoots using pH 3-10 and pH 4-7 IPG Strip

2.3.1 不同等電點范圍的蛋白點數(shù)的比較 圖6為勃氏甜龍竹筍總蛋白采用pH 3～10和pH 4～7不同膠條雙向電泳后在不同等電點范圍的蛋白點數(shù)的比較圖。由圖6可知，pH 3～10膠條的雙向電泳圖譜共檢測到蛋白點726個，其中pH 4～7范圍內(nèi)的蛋白點分布較多，約670個，占蛋白點總數(shù)的92.29%；而pH 3～4和pH 7～10范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)點分布較少，分別為19個和37個，占蛋白質(zhì)點總數(shù)的7.71%，可見勃氏甜龍竹的筍蛋白主要以酸性蛋白為主，堿性蛋白很少。pH 4～7膠條的雙向電泳圖譜共檢測到蛋白點數(shù)1 196個，明顯多于pH 3～10圖譜中此范圍的蛋白點數(shù)（670個），是后者的1.785倍多，其中pH 4～5范圍內(nèi)是1.43倍，pH 5～6范圍內(nèi)是1.72倍，pH 6～7范圍內(nèi)甚至達到4倍，可見，使用不同pH范圍膠條可提高特定范圍內(nèi)蛋白質(zhì)點的分辨率。因此，采用pH 4～7膠條比pH 3～10膠條獲得更多的蛋白點，而且蛋白點清晰可見，蛋白得到了有效的分離。

2.3.2 不同相對分子質(zhì)量范圍的蛋白點數(shù)比較 圖7為勃氏甜龍竹筍總蛋白采用pH 3～10和pH 4～7不同膠條雙向電泳后在各不同相對分子質(zhì)量范圍的蛋白點數(shù)的比較圖。由圖7可知，采用pH 4～7膠條在各不同相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)比pH 3～10膠條分離更多的蛋白點，在40～50 kDa范圍內(nèi)，甚至是pH 3～10膠條的3.77倍，其次在30～40 kDa范圍內(nèi)，達1.91倍。可見pH 4～7膠條更適合分離勃氏甜龍筍的蛋白。

圖6 pH 3～10和pH 4～7膠條上不同等電點范圍的蛋白點數(shù)的比較Fig.6 The comparison of protein spots of isoelectric point distribution between pH 3-10和pH 4-7 IPG Strip

圖7 pH 3～10和pH 4～7膠條上不同相對分子質(zhì)量范圍的蛋白點數(shù)的比較Fig.7 The comparison of protein spots of relative molecular mass distribution between pH 3-10和pH 4-7 IPG Strip

3 討論

蛋白質(zhì)提取和樣品制備是蛋白雙向電泳成功的前提和關(guān)鍵。目前提取植物蛋白的方法有很多，但由于不同植物或組織的生物學(xué)特性、生理生化特征有很大的差異，因此需要摸索出適合于不同植物及不同組織的最佳的蛋白提取方法以及雙向電泳條件。竹筍中富含的酚類、多糖、醌類、甾醇類等次生代謝產(chǎn)物會干擾蛋白的提純及雙向電泳。研究分析比較了TCA／丙酮法和改良TCA-酚法提取竹筍總蛋白。TCA／丙酮法是傳統(tǒng)的且應(yīng)用普遍的蛋白提取方法，首先，預(yù)冷后的TCA／丙酮溶液能有效地抑制生物樣品中的蛋白酶活性，減少樣品中的蛋白被這些蛋白酶所降解；其次，在提取過程中增加了洗滌和沉淀蛋白的次數(shù)則可以有效去除酚類、多糖、核酸等雜質(zhì)，從而獲得純度更高的蛋白［8］。改良酚法則可能由于，其提取步驟過于繁瑣，步驟過多，導(dǎo)致?lián)p失的蛋白較多，使得電泳圖譜上獲得的有效蛋白點數(shù)過少，而不適用于勃氏甜龍竹筍蛋白的提取。

研究表明采用24 cm、pH 4～7的IPG膠條，不僅實現(xiàn)了竹筍蛋白的有效分離，使每個pH單位鑒定出的蛋白點數(shù)目顯著增多，而且也使更多的低豐度蛋白顯現(xiàn)和分離出來。因此，采用pH 4～7窄范圍的IPG膠條比pH 3～10寬范圍的IPG膠條獲得的蛋白點數(shù)更多，反映的蛋白質(zhì)信息量更大，蛋白分離的效果更佳，因此，更適合于勃氏甜龍竹筍蛋白的雙向電泳。

勃氏甜龍竹的筍蛋白在pH 3～10范圍內(nèi)都有分布，但主要集中在pH 4～7范圍，以酸性蛋白為主（占92.29%），這與Ong等［9］報道的植物蛋白絕大部分都屬于酸性蛋白，并且功能性蛋白大多位于等電點pH 4～7的區(qū)域內(nèi)［10-12］相一致。勃氏甜龍竹的筍蛋白的分子量主要在10～40 kDa之間，這與毛竹筍（45～116 kDa）［13］、雷竹筍（45～116 kDa）［14］的蛋白質(zhì)明顯不同，以低分子量的蛋白為主。