夏莎莎，張 梓，夏瑞祥

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是漿細(xì)胞單克隆性增殖的惡性腫瘤，目前尚無根治方法。CD137配體(CD137 ligand，CD137L)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成員，在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[1-3]。CD137 / CD137L在抗原提呈細(xì)胞表面，起雙向信號(hào)傳導(dǎo)作用，CD137L介導(dǎo)的逆向信號(hào)促進(jìn)TNF分泌而抑制白介素10(interleukin- 10，IL- 10)分泌[4]。其中，IL- 10被認(rèn)為能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化及生長(zhǎng)，抑制免疫細(xì)胞的活化[5]。應(yīng)用抗CD137L抗體阻斷T細(xì)胞CD137-137L信號(hào)途徑，II類細(xì)胞因子IL- 10表達(dá)增高[6]。 研究[7]還顯示，IL- 10即可抑制機(jī)體的免疫功能從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，也能直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。該研究通過調(diào)節(jié)MM細(xì)胞內(nèi)CD137L基因表達(dá)，探究其對(duì)IL- 10的分泌和MM細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清、胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司；TB Green qPCR Master Mix試劑盒購(gòu)自日本Takara公司； β- actin抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司；鼠抗人IgG單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；定制的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)購(gòu)自德國(guó)凱基生物公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；鼠抗人CD137L單克隆抗體、人CD138微磁珠購(gòu)自德國(guó)miltenyi生物公司。

1.2 標(biāo)本采集收集2017年3月～2018年3月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科收治的16例MM患者，所有患者的診斷均符合《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2017年修訂)》[8]。選擇14例血小板輕度減少、骨髓象正常的患者作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。按照人CD138磁珠(德國(guó)miltenyi公司)分選說明書的操作，分離出漿細(xì)胞。本研究已獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象及家屬均已簽訂知情同意書。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染人MM 細(xì)胞株U266細(xì)胞采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，按2.5×105個(gè)/孔鋪于6孔板中，配制轉(zhuǎn)染體系：分別將4種150 ng siRNA溶于200 μl含血清培養(yǎng)基中，再加入12 μl Hiperfect，均勻混合后加入6孔板。

1.4 Western blot方法檢測(cè)CD137L蛋白相對(duì)表達(dá)量采用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白濃度。30 μg樣品經(jīng)SDS- PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，相應(yīng)一抗(CD137L抗體：德國(guó)miltenyi生物公司；β- actin：美國(guó)BD公司)孵育過夜，TBST洗3次后，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗3次，ECL發(fā)光法曝光、顯影，用Image Pro plus分析軟件分析各條帶灰度值。

1.5 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及RT- PCR法檢測(cè)CD137L mRNA相對(duì)表達(dá)量通過Trozel法提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific 公司)操作方法將 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，按照qPCR試劑盒(日本Takara公司)說明配制反應(yīng)體系。以β- actin為內(nèi)參，計(jì)算出CD137L mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.6 共培養(yǎng)及ELISA法檢測(cè)IL- 10的分泌水平采用密度梯度離心分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)3 d后去懸浮細(xì)胞后即得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，按2×104個(gè)/ml接種于6孔板，4 h棄上清液，備用。按下列方法設(shè)置4組。A組：MM細(xì)胞株U266單獨(dú)培養(yǎng)；B組：BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)；C組：未轉(zhuǎn)染的MM細(xì)胞株U266與BMSCs共培養(yǎng)即(U266- siRNA- 0+BMSCs)；D組：轉(zhuǎn)染編號(hào)為2的siRNA處理后的MM細(xì)胞株U266與BMSCs共培養(yǎng)即(U266- siRNA- 2+BMSCs)，24 h后收集上清液并使用Human IL- 10 ELISA Kit測(cè)各組IL- 10的分泌水平。

1.7 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況細(xì)胞經(jīng)處理后，加入10% CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)出波長(zhǎng)為450 nm的吸光度值(A450)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 CD137L在MM患者的漿細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)MM組患者骨髓血中漿細(xì)胞的CD137L蛋白表達(dá)(1.96±0.51)明顯高于對(duì)照組(1.00±0.29)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.460，P<0.001)。見圖1。

圖1 兩組患者骨髓血漿細(xì)胞CD137L蛋白表達(dá)水平

1、2： 非血液疾病患者；3、4：MM患者；與對(duì)照組比較：***P<0.001

2.2 CD137L基因沉默后mRNA表達(dá)明顯下降在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間，4條siRNA分別與對(duì)照組相比較，均可明顯下調(diào)U266細(xì)胞上CD137L mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(B：t=10.281,P=0.005；C：t=21.439,P=0.001；D：t=4.509,P=0.022；E：t=16.615,P=0.002)。見圖2。

圖2 siRNA沉默CD137L基因后mRNA表達(dá)水平

A：siRNA對(duì)照組；D～E：CD137L特異性siRNA；與siRNA對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3 下調(diào)U266細(xì)胞的CD137L表達(dá)可促進(jìn)IL- 10的分泌下調(diào)U266細(xì)胞內(nèi)CD137L表達(dá)可促進(jìn)共培養(yǎng)上清液中IL- 10的分泌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.732，P<0.01)。見表1。

表1 沉默CD137L基因?qū)266、BMSCs

與U266- siRNA- 0+BMSCs組比較：**P<0.01

2.4 沉默CD137L基因促進(jìn)U266細(xì)胞增殖與對(duì)照組(siRNA- 0)相比較，沉默組(siRNA- 2)U266細(xì)胞在72 h后增殖明顯加快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.730，P=0.021)。見圖3。

圖3 siRNA沉默CD137L基因?qū)266細(xì)胞增殖的影響

siRNA- 0： 對(duì)照組；siRNA- 2：CD137L特異性siRNA；與對(duì)照組比較：*P<0.05

3 討論

MM是一種終末未分化的惡性腫瘤[9]。目前MM已成為發(fā)病率排名第2的血液系統(tǒng)腫瘤，雖然硼替佐米等蛋白酶體抑制劑、單克隆抗體、免疫調(diào)節(jié)及自體造血干細(xì)胞移植術(shù)廣泛用于MM的治療，顯著改善了MM患者的預(yù)后，但至今未有徹底治療的方法[10]。CD137/CD137L介導(dǎo)的逆向信號(hào)能促進(jìn)單核細(xì)胞釋放巨噬細(xì)胞集落刺激因子從而影響細(xì)胞因子IL- 2、IL- 6、IL- 8、IL- 10等的分泌，其中IL- 10是作用機(jī)制十分復(fù)雜的腫瘤免疫抑制因子。IL- 10能作為自分泌或旁分泌生長(zhǎng)因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并能抑制細(xì)胞程序死亡，調(diào)節(jié)宿主微環(huán)境,影響腫瘤的轉(zhuǎn)移[11-13]。本實(shí)驗(yàn)用4種siRNA轉(zhuǎn)染MM細(xì)胞株U266降低其表面CD137L的表達(dá)，U266在骨髓微環(huán)境下IL- 10分泌水平上升，U266細(xì)胞增殖加快，這提示CD137L在MM中可通過抑制IL- 10的分泌影響MM的增殖。Gullo et al[14]研究顯示CD137L分子在MM中呈現(xiàn)高表達(dá)，激活CD137L逆向信號(hào)可以促進(jìn)炎性因子IL- 6和IL- 8的分泌，從而促進(jìn)MM細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，有研究[15]表明IL- 10參與了B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)以MM患者及非血液系統(tǒng)疾病患者的骨髓血為標(biāo)本，驗(yàn)證CD137L分子高表達(dá)于MM患者的漿細(xì)胞。在MM中CD137L是IL- 10分泌的抑制蛋白，CD137L的逆向信號(hào)在MM中的作用抑制IL- 10的分泌影響機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，利用CD137L作為靶點(diǎn)研究對(duì)于疾病的治療可能具有十分重要的臨床意義。