張玉玲，呂 萍，吳芳芳，楊 超，陳軍臣，薛汝增，郭君怡，陳俊溢，楊 斌

原發(fā)性皮膚淀粉樣變(primary cutaneous amyloidosis, PCA)指淀粉樣蛋白沉積于皮膚組織中而不累及其他器官的一種慢性皮膚病，少數(shù)患者有家族史，多數(shù)患者有瘙癢的癥狀，苔蘚樣淀粉樣變最常見(jiàn)。家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變(familial primary cutaneous amyloidosis, FPCA)多為青春期前后發(fā)病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與長(zhǎng)期刺激(如摩擦)、紫外線輻射、愛(ài)潑斯坦-巴爾二氏(Epstein-barr, EB)病毒感染、遺傳等因素相關(guān)[1]。2006年，Lee et al[2]通過(guò)全基因掃描技術(shù)，發(fā)現(xiàn)FPCA與染色體5p13.1- g11.2存在連鎖；2008年，Arita et al[3]首次發(fā)現(xiàn)FPCA致病基因?yàn)槎ㄎ挥谌旧w5p13.1- g11.2上的抑瘤素M受體(oncostatin M receptor, OSMR)基因。2010年，Lin et al[4]對(duì)臺(tái)灣29個(gè)FPCA進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)10個(gè)家系存在OSMR基因雜合錯(cuò)義突變，一個(gè)家系存在白介素- 31受體(interleukin- 31 receptor A，IL- 31RA)基因點(diǎn)突變，18個(gè)家系中無(wú)OSMR和IL31RA基因突變。無(wú)OSMR或者IL- 31RA基因突變的家系患者，其發(fā)病可能與其他遺傳因素相關(guān)。因此，通過(guò)對(duì)一家系進(jìn)行全基因組測(cè)序進(jìn)一步尋找FPCA患者可能候選致病性基因。

1 材料與方法

1.1 病例資料先證者女，見(jiàn)圖1中Ⅱ- 4，29歲，19歲時(shí)無(wú)明顯誘因下雙脛前出現(xiàn)對(duì)稱性的褐色針尖大小的丘疹，伴明顯瘙癢，后皮疹逐漸增至米粒大小，丘疹密集分布但不融合，見(jiàn)圖2，曾予多種藥物外用治療，皮疹未退，且易反復(fù)。其他系統(tǒng)檢查未見(jiàn)明顯異常。家族中先證者的父親(Ⅰ- 2)、哥哥(Ⅱ- 1)、弟弟(Ⅱ- 5)發(fā)病年齡分別為47、20、24歲，皮疹形態(tài)與先證者類似，Ⅱ- 1瘙癢癥狀重，Ⅱ- 5瘙癢癥狀輕，Ⅰ- 2無(wú)瘙癢。家族中其他成員否認(rèn)類似疾病史。先證者左小腿丘疹組織病理：可見(jiàn)真皮乳頭增寬，其內(nèi)可見(jiàn)均一嗜酸性團(tuán)塊狀物，剛果紅染色陽(yáng)性，見(jiàn)圖3。家族中的患者均在廣東省皮膚病醫(yī)院皮膚科確診為苔蘚樣皮膚淀粉樣變病。

圖1 PCA家系圖

Ⅱ- 4為先證者；*：采血并做基因檢測(cè)，其中Ⅲ- 3為Sanger測(cè)序，余均為二代測(cè)序

圖2 先證者的臨床表現(xiàn)

A: 先證者雙脛前褐色米粒大小的丘疹，丘疹密集分布但不融合；B：先證者皮損區(qū)的局部放大圖

圖3 先證者左小腿脛前皮損組織病理

A：箭頭處可見(jiàn)呈嗜伊紅性無(wú)結(jié)構(gòu)的玻璃樣物質(zhì)，沉積物與表皮間有裂隙 HE×200；B：剛果紅染色可見(jiàn)真皮乳頭均質(zhì)紅染的團(tuán)塊狀沉積物 ×200

1.2 方法

1.2.1基因組DNA提取 收集該家系中3例患者(Ⅰ- 2、Ⅱ- 1、Ⅱ- 4)和3例健康成員(Ⅰ- 1、Ⅱ- 2、Ⅲ- 3)的外周血5 ml，通過(guò)血液基因組DNA試劑盒(天根生化科技北京有限公司，貨號(hào)DP314)提取基因組DNA。本研究通過(guò)廣東省皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(GDDHLS- 20171029)，該家系成員在采取血樣前均簽署知情同意書(shū)。

1.2.2篩選可疑突變基因及位點(diǎn) 采用Hiseq 4000測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)對(duì)人樣本進(jìn)行全基因組測(cè)序，先對(duì)原始數(shù)據(jù)首先應(yīng)進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，將得到單核苷酸變異(single nucleotide variation, SNP)和插入缺失(insertion variation, InDel)位點(diǎn)與人類參考基因組比對(duì)，采用顯性遺傳模式對(duì)該家系進(jìn)行過(guò)濾，篩選外顯子區(qū)和剪接區(qū)變異(保留非同義突變和剪接區(qū)變異)，過(guò)濾掉高頻突變位點(diǎn)，得到該家系的基因突變位點(diǎn)。另外，對(duì)已知突變的OSMR基因的外顯子進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.2.3對(duì)滿足家系共分離及非同義突變的基因分析 利用在線人類孟德?tīng)栠z傳(online mendelian inheritance in man，OMIM)數(shù)據(jù)庫(kù)、基因本體(gene ontology, GO)數(shù)據(jù)庫(kù)和京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)分析其生物學(xué)特征及編碼蛋白可能的作用機(jī)制，之后利用SIFT、Polyphen- 2軟件篩選出能導(dǎo)致編碼蛋白功能異常的候選基因(候選位點(diǎn))，最后在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)逐個(gè)對(duì)以上候選基因進(jìn)行查閱。

2 結(jié)果

2.1 可疑突變基因及位點(diǎn)該家系中3例患者(Ⅰ- 2、Ⅱ- 1、Ⅱ- 4)和2例健康成員(Ⅰ- 1、Ⅱ- 2)經(jīng)二代測(cè)序，得到SNP和InDel位點(diǎn)數(shù)目分別為3 870 204個(gè)、819 403個(gè)，滿足家系共分離(顯性遺傳模式)的SNP和InDel位點(diǎn)數(shù)目分別為85 781個(gè)、11 078個(gè)。3例患者共有的SNP、InDel位點(diǎn)數(shù)目分別為21個(gè)、3個(gè)，共有的結(jié)構(gòu)變異(structure variation, SV)、拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV)位點(diǎn)數(shù)目分別為365個(gè)、152個(gè)。IL- 31RA基因中滿足家系共分離的SNP和InDel位點(diǎn)數(shù)目分別是5個(gè)和1個(gè)，OSMR基因中分別是4個(gè)和0個(gè)。

二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)，Ⅰ- 2、Ⅱ- 1、Ⅱ- 4患者的OSMR基因11號(hào)外顯子中第1 538位鳥(niǎo)嘌呤被腺嘌呤替代(c.1538G>A)，導(dǎo)致第513號(hào)氨基酸序列由甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?(p.Gly513Asp)；另外，Sanger測(cè)序檢測(cè)OSMR基因，在患者(Ⅰ- 2、Ⅱ- 1、Ⅱ- 4)及成員Ⅲ- 3中也發(fā)現(xiàn)了OSMR基因p.Gly513Asp位點(diǎn)突變；同時(shí)在正常人(Ⅰ- 1、Ⅱ- 2)和PCA患者(Ⅱ- 1、Ⅱ- 4)中還發(fā)現(xiàn)OSMR 基因第15號(hào)外顯子第2 090位腺嘌呤被胞嘧啶替代(c.2090A>C)，該位點(diǎn)突變可導(dǎo)致第697號(hào)氨基酸序列由賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(p.Lys697Thr)。通過(guò)OSMR基因Sanger測(cè)序與二代測(cè)序結(jié)果比對(duì)，在健康成員(Ⅰ- 1、Ⅱ- 2)和PCA患者(Ⅱ- 1、Ⅱ- 4)的二代測(cè)序的原始數(shù)據(jù)中也發(fā)現(xiàn)了OSMR基因p.Lys697Thr位點(diǎn)突變。見(jiàn)圖4。

2.2 滿足家系共分離及非同義突變的基因分析通過(guò)GO分析發(fā)現(xiàn)，這些基因主要富集在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中間絲、細(xì)胞骨架等細(xì)胞組件，參與信號(hào)傳感器活動(dòng)、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、蛋白偶聯(lián)受體活性、信號(hào)受體活性、受體活性等分子功能，涉及細(xì)胞黏附、生物黏附、細(xì)胞-細(xì)胞黏附、化學(xué)刺激的感官知覺(jué)、感官知覺(jué)等生物過(guò)程。KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，這些基因可能與黏附斑激酶通路、Janus蛋白酪氨酸激酶(Janus activated kinase, Jak)-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activators of transcription, STAT)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen- activated protein kinase， MAPK) 信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡通路等相關(guān)。使用SIFT、Polyphen- 2軟件對(duì)以上基因進(jìn)行有害性預(yù)測(cè)，最終篩選出26個(gè)候選基因：ANKRD30A、CHRNB2、CNTNAP5、CPA5、EPHB6、FLG2、GIMAP1- GIMAP5、GIMAP5、HNRNPU、KIAA0040、KIAA1549、KIRREL3、LOC155060、LRP6、MPZL2、OR1S2、PCDHA10、PCDHB8、PRH1、PRH1- TAS2R14、RIMKLB、RPS6KC1、SCARB2、SLC38A4、SYNE1、TNFSF18。對(duì)于OSMR基因，滿足家系共分離與非同義突變位點(diǎn)的SNP為1個(gè)，即p.Gly513Asp，但該位點(diǎn)在千人數(shù)據(jù)庫(kù)中的頻率為0.01，不滿足突變頻率小于0.005的這個(gè)條件，沒(méi)有被篩選出來(lái)；而另一個(gè)p.Lys697Thr位點(diǎn)也存在于健康對(duì)照者，不滿足家系共分離的條件，因此也沒(méi)有被篩選出來(lái)。對(duì)于IL- 31RA基因滿足家系共分離的SNP和InDel分別是5個(gè)和1個(gè)，但這些位點(diǎn)不滿足非同義突變這一條件，因此沒(méi)有被篩選出來(lái)。對(duì)以上26個(gè)基因逐個(gè)進(jìn)行文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(the low density lipoprotein receptor- related protein, LRP6)基因在阿爾茨海默病的淀粉樣前體蛋白的代謝過(guò)程、β淀粉樣蛋白的產(chǎn)生中起重要作用；絲聚蛋白2(filaggrin 2, FLG2)基因與皮膚的角化和皮膚屏障相關(guān)。LRP6、FLG2可能與FPCA發(fā)病相關(guān)。

圖4 FPCA患者基因測(cè)序結(jié)果

A：先證者OSMR基因的11號(hào)外顯子的部分測(cè)序圖；B、D：為健康對(duì)照者OSMR基因的11號(hào)、15號(hào)外顯子的部分測(cè)序圖；C：先證者OSMR 基因的15號(hào)外顯子的部分測(cè)序圖；箭頭表示突變位點(diǎn)

3 討論

FPCA是一種主要表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳的皮膚病，也可見(jiàn)常染色體隱性遺傳，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但其家族聚集性和種族易感性表明遺傳因素在該疾病的發(fā)生過(guò)程中可能有重要作用。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與FPCA發(fā)病最相關(guān)的基因是OSMR基因的突變，有報(bào)道[3-5]該基因突變可能會(huì)影響JAk- STAT、MAPK信號(hào)通路的激活，影響角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化、凋亡。OSMR基因突變位點(diǎn)主要集中于OSMRβ蛋白胞外區(qū)纖連蛋白- Ⅲ型亞區(qū)中，該突變可能會(huì)導(dǎo)致該亞區(qū)的受體域發(fā)生變化，影響受體域的空間構(gòu)型、定位和受體二聚化的形成[5]。本家系中OSMR基因p.Gly513Asp位點(diǎn)突變與郭獨(dú)一等[1]對(duì)兩家系OSMR基因全外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果一致，說(shuō)明OSMR基因的p.Gly513Asp位點(diǎn)突變可能是PCA的致病性基因突變位點(diǎn)。然而，Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)在本家系健康成員Ⅲ- 3也出現(xiàn)了OSMR基因p.Gly513Asp位點(diǎn)突變，隨訪Ⅲ- 3發(fā)現(xiàn)有瘙癢的表現(xiàn)，但是未表現(xiàn)出FPCA的體征，推測(cè)可能其暫未到發(fā)病年齡(Ⅲ- 3現(xiàn)年齡為7歲,其父親發(fā)病年齡為24歲)。除此之外，本家系中的OSMR基因p.Lys697Thr位點(diǎn)攜帶者Ⅰ1(女，33歲)、Ⅱ2(女，56歲)并未發(fā)病，可能是因?yàn)榄h(huán)境或其他因素的影響，導(dǎo)致突變位點(diǎn)在本家系部分成員中外顯缺失，未出現(xiàn)疾病表型。

通過(guò)對(duì)本家系成員全基因組測(cè)序，篩選出3例患者共有的SV、CNV 、SNP、InDel位點(diǎn)數(shù)目分別為365、152、21、3個(gè)。對(duì)編碼區(qū)SNP和InDel進(jìn)行多步過(guò)濾后再行GO、KEGG分析，發(fā)現(xiàn)這些基因參與信號(hào)傳感器活動(dòng)、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、蛋白偶聯(lián)受體活性、信號(hào)受體活性等分子功能，涉及細(xì)胞-細(xì)胞黏附、化學(xué)刺激的感官知覺(jué)等生物過(guò)程；可能與黏附斑激酶通路、Jak- STAT信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、mTOR信號(hào)、鈣信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡通路等相關(guān)。利用SIFT、PolyPhen- 2軟件對(duì)以上這些基因進(jìn)行有害性預(yù)測(cè)，最終篩選出26個(gè)候選基因，通過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn), LRP6基因、FLG2基因可能參與PCA的發(fā)病。

LRP是體內(nèi)一類多配基受體，在經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)中具有關(guān)鍵功能，而Wnt信號(hào)通路在淀粉樣前體蛋白的加工中可能具有重要作用。Liu et al[6]研究者在阿爾茨海默病患者的腦組織中發(fā)現(xiàn)LRP6水平降低，LRP6缺陷會(huì)影響阿爾茨海默病患者的神經(jīng)突觸，并有助于β淀粉樣蛋白產(chǎn)生和形成[7]。此外，LRP6與前體蛋白相互作用，激活非經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，增加β 淀粉樣蛋白的產(chǎn)生[8]。載脂蛋白E為L(zhǎng)RP配體之一，參與阿爾茨海默病淀粉樣物質(zhì)的形成過(guò)程[9]。載脂蛋白E 是PCA淀粉樣沉積物的主要成分之一[10]。因此，推測(cè)LRP6基因也可能與PCA的淀粉樣物質(zhì)的形成相關(guān)，但需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

FLG2基因編碼絲聚蛋白2，該蛋白為S100融合蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、氨基酸組成、表達(dá)模式和生物化學(xué)性質(zhì)方面與絲聚蛋白非常相似。FLG2蛋白和絲聚蛋白可能在表皮屏障的形成中具有重疊和協(xié)同作用，它們可以提供天然保濕因子的前體，從而保護(hù)皮膚免受環(huán)境侵害和水分逸出[11-12]。FLG2蛋白不僅可以維持上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，還有助于皮膚適當(dāng)?shù)慕腔?，因此許多皮膚屏障受損與該基因缺陷有關(guān)[13]。因此，推測(cè)FLG2基因功能異常可能促進(jìn)了PCA癥狀的發(fā)生或加重。

綜上所述，通過(guò)全基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，在一個(gè)PCA家系中證實(shí)了既往已報(bào)道的OSMR基因突變，并且還發(fā)現(xiàn)LRP6、FLG2基因也可能與PCA的發(fā)生相關(guān)，但仍需要大量樣本驗(yàn)證，相關(guān)功能需進(jìn)一步研究。