張美玲，張小俠，楊明珍，徐結(jié)茍

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B- cell lymphoma，DLBCL)是最常見淋巴細(xì)胞惡性腫瘤之一，占B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B cell non- Hodgkin lymphoma，B- NHL)30%～40%。它在組織形態(tài)、遺傳特征、免疫表型、臨床表現(xiàn)、對(duì)化療的反應(yīng)及預(yù)后都有著高度的異質(zhì)性。乙肝病毒(hepatits B virus，HBV)感染是全球公共衛(wèi)生問題，研究[1]報(bào)道DLBCL中HBV感染率高于普通人群，且感染HBV的DLBCL患者發(fā)病年齡較年輕、分期晚、預(yù)后差。然而，HBV在DLBCL發(fā)生發(fā)展過程中，病原學(xué)機(jī)制仍然是未知的。

活化誘導(dǎo)胞嘧啶脫氨酶(activation- induced cytidine deaminase，AID)是DNA/ RNA編輯酶，屬于載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白家族成員之一，誘導(dǎo)胞嘧啶(C)脫氨基成為尿嘧啶(U)，參與生發(fā)中心B細(xì)胞免疫球蛋白基因體細(xì)胞高頻突變(somatic hypermutation，SHM)和抗體的類別轉(zhuǎn)換(class- switch recombination，CSR)。Ren et al[2]的研究通過全基因組/外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與 HBsAg(-)DLBCL比較，HBsAg(+)DLBCL中出現(xiàn)較多的突變基因，可能是由AID介導(dǎo)異常的SHM。該文將進(jìn)一步研究AID在HBsAg(+)DLBCL和HBsAg(-)DLBCL中表達(dá)差異、與臨床特征關(guān)系，并對(duì)DLBCL患者生存預(yù)后影響因素進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 病例資料① 病例來源及分組：收集2009年1月～2017年9月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科94例具有完整臨床資料初治DLBCL患者石蠟組織切片，根據(jù)其中81例有完整乙肝五項(xiàng)檢查結(jié)果，分為HBsAg(+)組(HBsAg結(jié)果為陽性)和HBsAg(-)組(包括HBsAb陽性，其余全為陰性；或乙肝五項(xiàng)結(jié)果全為陰性)。② 納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合 DLBCL診斷標(biāo)準(zhǔn) (根據(jù)WHO 2016年淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn))；人類免疫缺陷病毒檢測(cè)均為陰性，血液、心臟等檢查結(jié)果均正常；年齡<80歲；均接受CHOP(環(huán)磷酰胺、表柔比星、長(zhǎng)春地辛及地塞米松)或RCHOP(利妥昔單抗+ CHOP)方案化療；知情同意。排除心、肝、腎等器官嚴(yán)重?fù)p害者、自身免疫病或由其他惰性B細(xì)胞淋巴瘤繼發(fā)的患者。

1.2 主要試劑與器材AID抗體購自美國Abcam公司(ab59361)；BCL2、BCL6即用型抗體購自福州邁新公司；通用型試劑盒(PV6000)、DAB顯色試劑盒、EDTA修復(fù)液、檸檬酸鹽修復(fù)液、PBS緩沖液、蘇木精染液、伊紅染液均購自北京中杉金橋公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1HE染色 所有組織經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，3 μm切片。切片置于65 ℃烤箱過夜，次日立即置于二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，水洗后置于蘇木精染液3 min，1%鹽酸乙醇分化后水洗，置于伊紅染液30 s，水洗后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.2免疫組化染色 脫蠟水化過程同HE染色，切片經(jīng)檸檬酸鹽高溫高壓修復(fù)，壓力閥均勻噴氣后約70 s(BCL2、BCL6抗體染色用EDTA修復(fù)液修復(fù))，自然冷卻降溫后，過氧化氫封閉10 min，PBS沖洗，滴加一抗室溫孵育2 h，AID工作濃度為1 ∶200， PBS 沖洗，滴加二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，自來水沖洗終止。核復(fù)染后，脫水透明，封片。用已知切片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.3結(jié)果判讀 AID蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，染色結(jié)果采用半定量方法，通過評(píng)估染色強(qiáng)度和腫瘤細(xì)胞陽性率計(jì)分，染色強(qiáng)度：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。細(xì)胞陽性率計(jì)分：每張切片高倍鏡(400倍)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞總數(shù)百分率，0%為0分，<5%為1分，5%～50%為2分，>50%為3分。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分及細(xì)胞陽性率評(píng)分相加所得積分，判定染色結(jié)果0～2分為陰性，3～6分為陽性。BCL2蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜、BCL6蛋白表達(dá)于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞百分率≥30%為陽性，<30%為陰性。

1.4 病例隨訪隨訪2009年～2016年12月初診為DLBCL患者，生存時(shí)間是從患者疾病診斷到死亡時(shí)間，若到隨訪截止日期2018年9月，患者仍存活，生存時(shí)間為疾病診斷到隨訪截止時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定性資料采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法比較各組間差異，二分類變量之間的關(guān)聯(lián)采用χ2檢驗(yàn)及列聯(lián)系數(shù)大小，3年累積生存率的統(tǒng)計(jì)采用Kaplan- Meier 生存分析(組間比較采用Log- Rank檢驗(yàn))，預(yù)后相關(guān)因素分析采用COX回歸模型。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV感染DLBCL組織中AID、BCL2、BCL6蛋白表達(dá)情況免疫組化分析94例DLBCL患者石蠟組織切片，AID蛋白表達(dá)66例(70.2%)； BCL2蛋白表達(dá)65例(73.0%)；BCL6蛋白表達(dá)54例(60.0%)。在HBsAg(+)組，AID(+)26例(86.7%)，HBsAg(-)組，AID(+)33例(64.7%)；組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032)。見圖1。

圖1 DLBCL組織HE染色及AID、BCL2、BCL6的表達(dá)

A：DLBCL組織HE染色 ×400；B、C、D：DLBCL組織免疫組化EnVision二步法 ×400；B：AID表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)；C：BCL2表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜；D：BCL6表達(dá)于細(xì)胞核

2.2 AID蛋白表達(dá)與DLBCL患者臨床特征關(guān)系94例DLBCL患者中，年齡16～76歲，中位年齡58歲，男54例，女40例，生發(fā)中心(germinal center B- cell- like，GCB)型37例，非生發(fā)中心(non- germinal center B- cell- like,non- GCB)型53例，AID(+)66例(70.2%)，AID(-)28例(29.3%)。AID(+)組中，≤60歲42例，>60歲24例，男41例，女25例；AID(-)組中，≤60歲14例，>60歲14例，男13例，女15例；AID蛋白表達(dá)與DLBCL患者年齡、性別、免疫學(xué)亞型、疾病分期、國際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index, IPI)評(píng)分、腫塊直徑、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)均無關(guān)系。見表1。

2.3 AID分別與BCL2、BCL6蛋白表達(dá)相關(guān)性分析AID 蛋白表達(dá)與BCL2蛋白表達(dá)無相關(guān)性(P=0.995)，與BCL6蛋白表達(dá)有相關(guān)性(P<0.001)。見表2。

2.4 DLBCL患者總體生存(overall survive，OS)分析

2.4.1AID蛋白表達(dá)、HBV感染與DLBCL患者OS關(guān)系 具有隨訪資料的69例DLBCL患者中，中位隨訪時(shí)間為39.1個(gè)月。AID(+)組和AID(-)組3年累積生存率分別為66.3%、68.2%(P=0.805)，見圖2A；HBsAg(+)組和HBsAg(-)組3年累積生存率分別為51.4%、76.2%(P=0.035)，見圖2B；AID/ HBsAg共陽性組和非共陽性組3年累積生存率分別為44.1%、71.5%(P=0.038)。見圖2C。

表1 DLBCL患者AID蛋白表達(dá)與乙肝感染等臨床特征關(guān)系[n(%)]

aHBsAg(+)組共30例；HBsAg(-)組共51例，包括① HBsAg(-),HBsAb(+),HBeAg(-),HBeAb(-),HBcAb(-)；② HBsAg(-),HBsAb(-),HBeAg(-),HBeAb(-),HBcAb(-)；b根據(jù)Hans分類，DLBCL分為GCB型和non- GCB型，本研究中只有90例具有完整免疫學(xué)亞型分類資料

表2 AID與BCL2、BCL6蛋白表達(dá)的相關(guān)性[n(%)]

2.4.2AID蛋白表達(dá)與不同免疫學(xué)亞型DLBCL患者OS關(guān)系 26例GCB型DLBCL患者中，AID(+)組和AID(-)組3年累積生存率分別為82.4%、77.8%(P=0.922)，見圖3A；41例non- GCB型DLBCL患者中，AID(+)和AID(-)3年累積生存率分別為48.1%、80.0%(P=0.046)，見圖3B；26例GCB型DLBCL患者中，AID/HBsAg共陽性組與非共陽性組，3年累積生存率分別為83.3%、79.3% (P=0.874)，見圖3C；41例non- GCB型DLBCL患者中，AID/HBsAg共陽性組與非共陽性組，3年累積生存率分別為34.1%、67.2%(P=0.003)。見圖3D。

2.5 DLBCL患者預(yù)后分析

2.5.1單因素分析 單因素COX回歸分析：HBsAg(+)、HBsAg/AID共陽性、免疫學(xué)亞型為non- GCB型、IPI評(píng)分3～5分均為DLBCL患者OS的不良預(yù)后因素(P<0.05)。見表3。

2.5.2多因素分析 多因素COX回歸分析： HBsAg/AID共陽性、免疫學(xué)亞型為non- GCB型、IPI評(píng)分3～5分均為DLBCL患者OS的獨(dú)立的不良預(yù)后因素(P<0.05)。見表3。

3 討論

淋巴瘤是起源于淋巴結(jié)和淋巴組織，屬于免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤。其發(fā)生大多與參與免疫應(yīng)答過程中某種免疫細(xì)胞的惡變有關(guān)，但具體病因未知，關(guān)于淋巴瘤病因?qū)W的研究表明，病毒感染是主要危險(xiǎn)因素。既往研究[3]表明，不同的病毒類型，包括人類免疫缺陷病毒、EB病毒、人類T細(xì)胞淋巴瘤/白血病病毒、人類皰疹病毒8，丙肝病毒、HBV均可能有助于某些淋巴瘤發(fā)生。Meta分析表明，感染HBV患者患非霍奇金淋巴瘤(non- Hodgkin lymphoma,NHL)風(fēng)險(xiǎn)增加，且B- NHL與HBV感染相關(guān)性強(qiáng)于T細(xì)胞NHL。在B- NHL中，HBV感染與DLBCL有明顯相關(guān)性(比值比：2.06； 95%CI：1.48～2.88)[4]。

圖2 AID蛋白表達(dá)、HBV感染與 DLBCL患者OS關(guān)系

圖3 AID蛋白表達(dá)及與HBsAg共陽性分別與不同免疫學(xué)亞型DLBCL患者OS關(guān)系

A、B：AID蛋白表達(dá)分別在GCB型和non- GCB型DLBCL患者OS比較；C、D：AID/HBsAg共陽性組和AID/HBsAg非共陽性組分別在GCB型和non- GCB型DLBCL患者OS比較

表3 影響DLBCL患者OS單因素及多因素COX回歸分析

AID在生發(fā)中心中表達(dá)，正常情況下，通過免疫球蛋白基因體細(xì)胞SHM和CSR促使抗體親和力成熟和B細(xì)胞表面受體亞型改變，而異常的體細(xì)胞突變或基因結(jié)構(gòu)改變將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。既往研究報(bào)道，AID在許多B細(xì)胞腫瘤中表達(dá)，包括濾泡性淋巴瘤[5]、黏膜相關(guān)性淋巴瘤[6]、慢性淋巴細(xì)胞白血病[7]、彌漫大B細(xì)胞性淋巴瘤，且對(duì)于DLBCL患者具有預(yù)后意義[8]。本實(shí)驗(yàn)在DLBCL組織中，AID表達(dá)陽性率70.2%，且在HBsAg(+)組中AID蛋白表達(dá)陽性率高于HBsAg(-)組，表明AID與HBV感染DLBCL有相關(guān)性。AID在多種不同類型腫瘤發(fā)病中起重要作用，例如Hp感染導(dǎo)致的胃癌[9]、炎癥性腸病發(fā)展為結(jié)腸癌[10]，是由于病原體或炎性因子活化，通過核轉(zhuǎn)錄因子κB信號(hào)通路上調(diào)AID，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展；EBV相關(guān)的淋巴瘤是通過EBV感染產(chǎn)生潛伏膜蛋白上調(diào)AID mRNA，進(jìn)而導(dǎo)致B細(xì)胞淋巴瘤生成[11]。在DLBCL中，HBV感染是否通過某種機(jī)制上調(diào)AID表達(dá)，通過改變下游靶基因，從而促進(jìn)DLBCL發(fā)生發(fā)展。具體機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

BCL2基因是一種癌基因，編碼BCL2抗凋亡蛋白，課題組前期研究[12]顯示，HBV可能通過BCL2作用參與DLBCL的發(fā)生發(fā)展。本研究中AID與BCL2蛋白表達(dá)無相關(guān)性，但AID是否能影響B(tài)CL2基因變化，需要后續(xù)進(jìn)一步基因檢測(cè)研究。BCL6基因是一種B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生中的原癌基因，編碼生發(fā)中心反應(yīng)所需的轉(zhuǎn)錄抑制因子，是生發(fā)中心標(biāo)志物，AID蛋白與BCL6蛋白表達(dá)有一定相關(guān)性， AID可能通過促進(jìn)BCL6基因突變或基因重排[13]，抑或可能促進(jìn)BCL6啟動(dòng)子甲基化，最終抑制BCL6蛋白的表達(dá)[14]。具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

DLBCL患者生存分析中， AID(+)組生存率低于AID(-)組，且在non- GCB患者中，AID(+)組生存率低于AID(-)組，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在non- GCB型DLBCL中，AID可能加速了腫瘤的進(jìn)展，進(jìn)而縮短患者生存時(shí)間。AID/HBsAg共陽性組生存率明顯低于非共陽性組，進(jìn)一步說明AID是HBV感染DLBCL的不良預(yù)后因素，多因素COX回歸分析中也證實(shí)了免疫學(xué)亞型為non- GCB型、AID/HBsAg共陽性均是DLBCL獨(dú)立不良預(yù)后因素。

綜上，AID蛋白在HBV感染DLBCL中表達(dá)高，與BCL6蛋白表達(dá)有一定相關(guān)性，在non- GCB中AID表達(dá)陽性的患者預(yù)后差，有助于HBV相關(guān)DLBCL發(fā)病機(jī)制的研究，后續(xù)需要擴(kuò)大樣本量并行基因檢測(cè)來進(jìn)一步研究具體發(fā)病機(jī)制，期待能為HBV相關(guān)DLBCL患者精準(zhǔn)治療提供有利的理論依據(jù)。