吳 君，汪銀鳳，潘春晨

慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)是耳鼻喉科常見的涉及鼻竇和鼻黏膜的慢性炎癥性疾病，具有異質(zhì)性和復(fù)雜發(fā)病機制，目前分為兩種類型：慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉 (chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP) 和慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)[1]。CRSwNP主要是以組織Th2炎癥及嗜酸粒細胞浸潤為主，而區(qū)別于CRSsNP以 Th1炎癥為主[2]。CRSwNP依據(jù)是否伴有嗜酸粒細胞浸潤，可以進一步分為兩種亞型：嗜酸粒細胞性慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(eosinophilic CRSwNP，ECRS) 和非嗜酸粒細胞性慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(non- eosinophilic CRSwNP，non- ECRS)[3]。ECRS相較non- ECRS而言，有更高的臨床疾病嚴(yán)重程度體驗和術(shù)后更易復(fù)發(fā)的風(fēng)險[4]。BTB與CNC同源基因2(BTB and CNC homology2，Bach2)定位在人的6號染色體的長臂(6q15)，其轉(zhuǎn)錄的蛋白能夠與小Maf蛋白(包括MafF、MafG和MafK)結(jié)合形成異源二聚體，并在DNA上結(jié)合特異性序列上Maf識別元件，從而抑制細胞轉(zhuǎn)錄并參與其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程[5]。Bach2參與T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，Treg介導(dǎo)的免疫穩(wěn)態(tài)，并調(diào)節(jié)Th2細胞分化和Th2型免疫反應(yīng)，而Bach2缺陷型小鼠易患致命性肺部和小腸感染[6-7]。而對于Bach2是否在慢性鼻-鼻竇炎中表達仍未有研究報道，該研究首次探究Bach2在不同表型的鼻息肉組織中的分布情況及與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料43例CRSwNP患者分為嗜酸性慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組(ECRS組)19例、非嗜酸性慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組(non- ECRS組)24例，受試者對照組(Control組)20例。所有研究對象均來自安徽省立醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科。慢性鼻-鼻竇炎的診斷均符合國內(nèi)2012年的慢性鼻-鼻竇炎診療指南[1]。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 患者在手術(shù)前1個月內(nèi)使用局部或全身性類固醇激素；② 既往有鼻竇手術(shù)史，術(shù)前患有真菌性鼻竇炎、后鼻孔息肉、原發(fā)性纖毛運動障礙、變應(yīng)性鼻炎、哮喘、肺結(jié)核等感染性疾病和過敏性疾病的病患。CRSwNP進一步分為ECRS和non- ECRS兩種亞型，根據(jù)先前的研究，當(dāng)選取的10個高倍鏡視野(high- power fields，HPF)平均組織嗜酸粒細胞的百分比超過浸潤細胞總數(shù)的10%時，CRSwNP即被歸類為ECRS，反之則為non- ECRS[8]，見圖1。20例無慢性鼻-鼻竇炎的對照受試者，因腦脊液鼻漏、外傷及腫瘤(包括篩竇骨瘤、神經(jīng)鞘瘤、腺樣囊性癌)而進行手術(shù)，在手術(shù)過程中收集其篩竇黏膜。所有活組織標(biāo)本均分為兩部分:一部分用多聚甲醛固定后，用石蠟包埋固定切片進行蘇木精-伊紅 (hematoxylin- eosin，HE)染色和免疫組化(immunohistochemistry，IHC)染色;另一部分存儲在-80 ℃用于檢測Bach2蛋白和基因表達水平。本研究所有受試者的基本人口特征見表1。本研究經(jīng)安徽省立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，每位受試者術(shù)前簽署知情同意書。

圖1 兩組鼻息肉組織中嗜酸粒細胞的表達 ×400A: 嗜酸性鼻息肉組織；B: 非嗜酸性鼻息肉組織

表1 人口特征表

1.2 方法

1.2.1受試者的臨床資料收集 收集受試者的病史、術(shù)前臨床檢查(包括鼻內(nèi)鏡檢查和鼻竇CT檢查)，用Lund- Kennedy鼻內(nèi)鏡評分(Endoscopy評分)、Lund- Mackay鼻竇CT評分(CT評分)及視覺量表評分(visual analogue scale，VAS評分)來評估受試者的疾病嚴(yán)重程度[1]。

1.2.2免疫組化染色 組織標(biāo)本用石蠟包埋固定后，制成3 μm厚石蠟組織切片，行 HE染色和IHC染色, 檢測平均嗜酸粒細胞數(shù)和Bach2的表達情況。采用免疫組化 SP法，切片脫蠟水化、抗原修復(fù)及封閉內(nèi)源性過氧化氫酶后，用抗人Bach2第一抗體(1 ∶100，美國Affinity公司) 在4 ℃條件下孵育過夜。切片第2天用HRP羊抗兔Bach2第二抗體(1 ∶200，美國Affinity公司)孵育，然后用DAB溶液顯色，復(fù)染、脫水、透明和封片。最后，由兩名研究者盲法觀察每個切片的IHC染色。從每個切片隨機選擇5個高倍鏡視野(HPF)使用Image J軟件(美國馬里蘭州Bethesda公司)計算染色切片的光密度值(integrated optical density，IOD)。

1.2.3定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 用TRIzol試劑和氯仿試劑從活檢組織中提取總RNA，然后用Prime ScriptTMRT Master Mix(中國大連Takara公司,No.RR036A) 試劑逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用設(shè)計引物和TB GreenTMPremix Ex TaqTM II(大連Takara 公司,No.RR820A)依據(jù)試劑說明書進行40個循環(huán)定量聚合酶鏈反應(yīng)，以檢測Bach2的表達。設(shè)計的引物序列如表2。目標(biāo)基因表達水平用2-ΔΔCT法計算。

表2 Bach2 mRNA 擴增所需的引物序列

1.2.4Western blot法 Bach2蛋白的表達用Western blot法進行檢測。用裂解液(PMSF)和勻漿法從活檢組織中提取總蛋白，檢測到蛋白質(zhì)的濃度后，加樣 SDS- PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；膜用TBS緩沖液浸潤，后用含5%脫脂奶粉的緩沖液封閉，用抗人Bach2第一抗體(1 ∶500)在4 ℃條件下過夜；之后，將膜用HRP羊抗兔Bach2第二抗體(1 ∶3 000)在室溫下孵化30 min，依次用顯影劑和定影劑進行顯影和定影；最后將膠片拍照并存檔，使用Image J軟件(美國馬里蘭州Bethesda公司)處理系統(tǒng)分析靶蛋白的光密度值。

2 結(jié)果

2.1 Bach2在ECRS中低表達與嗜酸粒細胞數(shù)相關(guān)如圖2A～2C中所示，Bach2主要表達于鼻腔黏膜上皮層的細胞核中。免疫組化染色光密度值定量分析表明，與 non- ECRS組比較，ECRS組中Bach2的表達顯著減少(P<0.01)。ECRS患者的 Bach2的表達與對照組比較相對較高(P<0.01)。Bach2的mRNA和蛋白在ECRS 組中的表達水平與non- ECRS組相比顯著降低(P<0.05,P<0.01)，而高于對照組(P<0.05,P<0.01)，見圖3、4。Bach2的mRNA相對表達水平與ECRS組織中的每高倍鏡視野嗜酸粒細胞數(shù)(eosinophilics/HPF)間存在負相關(guān)性(P<0.05)，見圖3。

圖2 免疫組化染色檢測 Bach2 在不同組中的表達 ×400

A: Control組；B: ECRS組；C: non- ECRS組；與non- ECRS組比較：**P<0.01；與ECRS組比較：##P<0.01

2.2 Bach2表達與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性在ECRS組中，CT評分和Endoscopy評分與Bach2的表達間有一定的相關(guān)性(P<0.01，P<0.05); 而VAS評分與Bach2 表達水平間無顯著相關(guān)(P>0.05)；而在non- ECRS組中，Endoscopy評分與 Bach2的表達間有一定的相關(guān)性(P<0.01); 而CT評分及VAS評分與Bach2表達水平間無顯著相關(guān)(P>0.05,P>0.05),見圖5。

3 討論

CRS 是耳鼻喉科常見的易復(fù)發(fā)、影響生活質(zhì)量的炎癥性疾病，由于其病理生理機制不清及異質(zhì)性，已成為臨床研究的熱點。T細胞在CRS的眾多病理生理機制中起著至關(guān)重要的作用[2]。其中，CRSsNP主要以Th1炎癥為主，Th2炎癥與嗜酸粒細胞浸潤在CRSwNP發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用。對于不同類型CRS中炎癥細胞的調(diào)節(jié)機制、分化和增殖的研究，一直是不同類型CRS的分子機制的研究方向。Bach2 基因是Bach2家族成員之一，主要表達在T細胞、B細胞和神經(jīng)細胞中，并調(diào)控這些細胞。最近的研究[7]表明，Bach2參與維持T細胞免疫穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)效應(yīng)T細胞、記憶T細胞及Treg細胞的產(chǎn)生和功能維持。此外，Bach2缺乏能促進Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)[9]。然而，Bach2是否參與CRS的發(fā)病機制及慢性鼻-鼻竇炎中Th2免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)尚待闡明。

本研究中，分別用定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、免疫組化染色和蛋白質(zhì)印跡法測定Bach2在慢性鼻竇炎不同表型中的表達分布情況。實驗結(jié)果表明，Bach2主要表達在鼻黏膜上皮層，且在ECRS組息肉上皮層中表達顯著低于non- ECRS組。因此，猜想Bach2參與ECRS的發(fā)病機制與上皮的功能障礙有關(guān)，而進一步的結(jié)果顯示，ECRS組織中的eosinophilics/HPF與Bach2的表達呈負相關(guān)性，更加驗證了這一猜想，表明Bach2基因存在負向調(diào)節(jié)ECRS中嗜酸性炎癥機制。氣道上皮細胞在接觸到病原體或過敏原后能夠產(chǎn)生眾多炎癥介質(zhì)，因此在黏膜炎癥的發(fā)生中起著重要的作用；而上皮功能障礙是鼻竇炎的發(fā)病機制之一[2]。上皮細胞構(gòu)成鼻腔和鼻竇的先天免疫，通過分泌S100A8/A9、claudin- 1、occludin等蛋白，抵抗細菌的侵襲，清除潛在的病原體[2]。與CRSsNP和對照組相比，這些蛋白在CRSwNP中的表達減少，可能增加病原體入侵的風(fēng)險，從而導(dǎo)致炎癥[10-11]。然而，本研究中尚無明確證據(jù)表明Bach2參與到這種上皮功能受損的分子機制，因此可能需要更多的研究來探索這種調(diào)節(jié)機制是否存在。Kuwahara et al[12]觀察到 Bach2敲除小鼠肺中Th2細胞因子IL- 5和IL- 13的表達增加，并且與對照小鼠相比，支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞浸潤增多。同時，Bach2敲除小鼠的胸腺中 Foxp3+CD4 T細胞數(shù)量為對照小鼠的一半，并且自發(fā)形成了特定的Th2型過敏性氣道炎癥。由于鼻黏膜細胞的上皮形態(tài)和表達方式與支氣管細胞相同，即說明氣道上皮的連續(xù)性和氣道上皮炎癥的類似分子機制[13]。這一實驗的結(jié)果也說明了 Bach2對于氣道炎癥方面的抑制作用。

圖3 Bach2在不同組中mRNA的相對表達水平及與組織中嗜酸粒細胞數(shù)的相關(guān)性

A：三組中Bach2 mRNA的相對表達水平；B：Bach2 mRNA的相對表達水平與ECRS組中每高倍鏡視野嗜酸粒細胞數(shù)的相關(guān)性；C：Bach2 mRNA的相對表達水平與non- ECRS組中每高倍鏡視野嗜酸粒細胞數(shù)的相關(guān)性；與non- ECRS組比較：*P<0.05；與ECRS組比較：#P<0.05

圖4 Western blot檢測Bach2與內(nèi)參蛋白β- actin在不同組中的表達

與non- ECRS組比較：**P<0.01；與ECRS組比較：##P<0.01

Bach2可限制包括Th1、Th2和Th17細胞在內(nèi)的多個Th效應(yīng)細胞群的完全分化，直接調(diào)控與Th極化和分化相關(guān)的基因，如Irf4、Gata3和Ahr等[7]。最近的研究顯示，Bach2可以通過幾種不同的途徑調(diào)節(jié)Th2免疫反應(yīng)和Th2細胞分化。其中關(guān)鍵一種途徑為，Bach2結(jié)合堿性亮氨酸拉鏈ATF樣轉(zhuǎn)錄因子Batf，結(jié)合Th2細胞因子調(diào)控位點，阻斷Th2 細胞因子的產(chǎn)生和(或)Th2細胞分化[12]。此外，Bach2敲除的小鼠體內(nèi)，Batf的缺失也促進了自發(fā)性2型氣道炎癥的發(fā)展[14]。雖然有大量證據(jù)表明Bach2在調(diào)節(jié) Th2免疫反應(yīng)和維持免疫穩(wěn)態(tài)方面具有關(guān)鍵作用，但具體的分子機制仍然尚未完全明確。

本研究的相關(guān)性分析結(jié)果表示，Bach2基因表達水平與疾病的嚴(yán)重程度及組織中嗜酸粒細胞數(shù)之間有一定的相關(guān)性；初步建立了Bach2與鼻竇黏膜上皮中 Th2介導(dǎo)的嗜酸粒細胞炎癥及ECRS疾病嚴(yán)重程度之間的聯(lián)系。這說明在ECRS的發(fā)病機制和不同CRS亞表型的形成中，Bach2發(fā)揮了重要作用。因此，可以進一步猜測通過檢測Bach2的表達，來評估2型免疫反應(yīng)主導(dǎo)的嗜酸性炎癥程度和病變損害程度，為疾病的診治提供新的理論依據(jù)。然而，仍需要更多的臨床數(shù)據(jù)分析來驗證這一設(shè)想，以便提供更多的證據(jù)來預(yù)測CRS的嚴(yán)重程度和預(yù)后。

圖5 Bach2的相對mRNA的表達量與臨床的相關(guān)性

A：Bach2 mRNA的相對表達水平與ECRS組中CT評分、Endoscopy評分及VAS評分之間的相關(guān)性；B：Bach2 mRNA的相對表達水平與non- ECRS組中CT評分、Endoscopy評分及VAS評分之間的相關(guān)性

本研究顯示，Bach2在ECRS組中顯著低表達，而致鼻息肉上皮嗜酸性炎癥，并與臨床疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。然而，還需要進一步的研究來探究Bach2在上皮炎癥發(fā)展過程中調(diào)節(jié)炎癥細胞的具體機制，以及是否能通過其表達水平來診療和預(yù)測ECRS的預(yù)后。