李 云，陳 博，王 凡

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，在全球呈多發(fā)趨勢(shì)，且病死率較高，胃癌的發(fā)病率、死亡率分別位于惡性腫瘤的第5位及第3位，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。其治療主要以手術(shù)切除聯(lián)合周圍淋巴結(jié)清掃為主，除此之外，化療在胃癌的治療上也起到重要的輔助作用[2]。紫杉醇是一種新型的紫杉類藥物，臨床上常用于晚期胃癌的治療[3-4]，但對(duì)紫杉醇不敏感的胃癌細(xì)胞株能否通過其他藥物的協(xié)同作用增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的敏感性，值得進(jìn)一步探討。甲氟喹是FDA批準(zhǔn)的治療和預(yù)防瘧疾的藥物，在過去的幾年里，甲氟喹被嘗試用于治療其他疾病，且取得明顯的效果。研究表明，甲氟喹可以作為一種新型抗癌藥物用于惡性腫瘤的治療，Sukhai et al[5]采用甲氟喹作用于急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可通過滲透入白血病細(xì)胞的溶酶體中，破壞溶酶體膜蛋白，進(jìn)而有選擇性的殺死白血病細(xì)胞及干細(xì)胞，為通過破壞細(xì)胞溶酶體治療AML提供了理論依據(jù)。Li et al[6]研究表明甲氟喹可通過抑制腫瘤細(xì)胞線粒體增殖及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的凋亡，且與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用起到協(xié)同作用。然而，甲氟喹對(duì)紫杉醇不敏感型胃癌的作用及其分子機(jī)制鮮有報(bào)道。磷脂肌醇3- 激酶(phosphoinositide- 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路是人體細(xì)胞中的一條重要信號(hào)傳導(dǎo)通路，在細(xì)胞中起著促進(jìn)增殖、抑制凋亡的作用，與包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展緊密相關(guān)[7-8]。能夠識(shí)別并抑制PI3K/Akt/mTOR通路的藥物可能提高胃癌治療的療效。該研究將甲氟喹和紫杉醇聯(lián)合作用于對(duì)紫杉醇不敏感的胃癌細(xì)胞株BGC- 823，研究?jī)伤幝?lián)合對(duì)紫杉醇不敏感胃癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑SGC- 7901及BGC- 823細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自Gibco公司；小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；甲氟喹和紫杉醇購(gòu)自美國(guó)Sigma- Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胃腺癌細(xì)胞系SGC- 7901及BGC- 823細(xì)胞采用含10%小牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁性生長(zhǎng)。

1.2.2PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以每孔板2×103個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板(200 μl/孔，37 ℃、5% CO2，飽和濕度，邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)。細(xì)胞貼壁后即加入藥物，實(shí)驗(yàn)組分別加入0.5 μmol/L甲氟喹，0.3 μmol/L紫杉醇，0.5 μmol/L甲氟喹聯(lián)合0.3 μmol/L紫杉醇，同時(shí)設(shè)對(duì)照組(只加細(xì)胞和培養(yǎng)液，不加藥物)。收集藥物作用后的細(xì)胞上清液，用預(yù)冷PBS洗滌2次，低速離心棄上清液，每孔加入750 μl熒光染料碘化丙啶(PI)，37 ℃避光作用20 min后收集細(xì)胞，4 ℃避光過夜。次日使用流式細(xì)胞儀(FASCalibur)檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果用WinMDI 2.9軟件分析，亞二倍體峰(subG1)所占的比例即細(xì)胞凋亡率。

1.2.3MTS測(cè)定細(xì)胞活性 細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)組分別加入0.5 μmol/L甲氟喹，0.3 μmol/L紫杉醇，0.5 μmol/L甲氟喹聯(lián)合0.3 μmol/L紫杉醇，同時(shí)設(shè)對(duì)照組(只加細(xì)胞和培養(yǎng)液，不加藥物)。5% CO2、37 ℃孵育24 h后每孔加20 μl MTS/PMS混合液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。檢測(cè)前搖晃培養(yǎng)板10 s，混勻顏色。在酶聯(lián)檢測(cè)儀上，波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值。

1.2.4Western blot法 將BGC- 823細(xì)胞接種到6孔板中，對(duì)照組加入培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入0.5 μmol/L甲氟喹，0.3 μmol/L紫杉醇，0.5 μmol/L甲氟喹聯(lián)合0.3 μmol/L紫杉醇，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，在冰上加入RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，于4 ℃、14 000 r/min離心30 min，吸取上清液。BCA蛋白定量法測(cè)總蛋白的濃度。在15% SDS- PAGE膠中每孔加入蛋白總量30 μg，電泳條件為70 V/40 min，110 V/90 min。220 mA、60 min轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用含5%的脫脂奶粉/TBST室溫封閉2 h，LC3抗體4 ℃ 孵育過夜，次日TBST洗滌3次，每次10 min；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min；于全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行曝光，檢測(cè)p- PI3K、PI3K、p- Akt、Akt、p- mTOR、mTOR表達(dá)水平并保存圖像。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡選用0.3 μmol/L紫杉醇在不同時(shí)間點(diǎn)分別處理SGC- 7901和BGC- 823細(xì)胞，檢測(cè)其凋亡率，結(jié)果顯示紫杉醇誘導(dǎo)SGC- 7901細(xì)胞48 h凋亡率為(55.33±2.08)%，BGC- 823的凋亡率為(23.33±1.53)%，說明紫杉醇對(duì)SGC- 7901和BGC- 823細(xì)胞都有誘導(dǎo)凋亡作用，但相比較而言，BGC- 823細(xì)胞對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)的凋亡更加不敏感，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.05，P<0.05)，見圖1。

圖1 48 h內(nèi)紫杉醇誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞BGC- 823和SGC- 7901凋亡率的變化

2.2 甲氟喹能夠抑制細(xì)胞活性且增加BGC- 823細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性在對(duì)紫杉醇不敏感的細(xì)胞株BGC- 823中分別加入0.5 μmol/L甲氟喹、0.3 μmol/L紫杉醇、0.5 μmol/L甲氟喹聯(lián)合0.3 μmol/L紫杉醇，同時(shí)設(shè)對(duì)照組(只加細(xì)胞和培養(yǎng)液，不加藥物)。通過染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，MTS檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果顯示，甲氟喹聯(lián)合紫杉醇較單用紫杉醇能更明顯地誘導(dǎo)BGC- 823細(xì)胞凋亡[(33.00±2.83)%vs(15.75±0.64)%]，抑制細(xì)胞增殖[(44.00±0.07)%vs(72.00±0.09)%]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.18，P<0.05；F=22.58，P<0.05)(圖2A、2B)。

圖2 各組處理24 h后胃癌細(xì)胞BGC- 823凋亡率、增殖率比較

A： 凋亡率比較；B：增殖率比較；1：對(duì)照組；2：0.5 μmol/L甲氟喹；3：0.3 μmol/L紫杉醇；4：0.5 μmol/L甲氟喹+0.3 μmol/L紫杉醇；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與單藥紫杉醇組比較：#P<0.05

圖3 甲氟喹、紫杉醇對(duì)胃癌細(xì)胞BGC- 823中PI3K/Akt/mTORA信號(hào)通路總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平的影響

A：Western blot圖像；B：mTOR蛋白相對(duì)灰度值；C：p- mTOR蛋白相對(duì)灰度值；1：對(duì)照組；2：0.5 μmol/L甲氟喹；3：0.3 μmol/L紫杉醇；4：0.5 μmol/L甲氟喹+0.3 μmol/L紫杉醇；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與單藥紫杉醇組比較：#P<0.05

2.3 甲氟喹通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)胃癌細(xì)胞BGC- 823對(duì)紫杉醇的敏感性在對(duì)紫杉醇不敏感的細(xì)胞株BGC- 823中分別加入0.5 μmol/L甲氟喹、0.3 μmol/L紫杉醇、0.5 μmol/L甲氟喹聯(lián)合0.3 μmol/L紫杉醇，Western blot法檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR通路的總蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，無(wú)藥物處理組中PI3K/Akt/mTOR通路的總蛋白及磷酸化蛋白相關(guān)基因表達(dá)水平較高，而甲氟喹聯(lián)合紫杉醇作用后，PI3K/Akt/mTOR通路的總蛋白相關(guān)基因表達(dá)水平無(wú)變化，但磷酸化蛋白較單用甲氟喹，紫杉醇處理的實(shí)驗(yàn)組及無(wú)藥物處理組明顯降低，說明甲氟喹可以協(xié)同紫杉醇抑制PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化蛋白的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.05，P<0.05)，見圖3A、3B、3C。

3 討論

胃癌在我國(guó)發(fā)病率較高，是一種常見的消化道惡性腫瘤，因早期胃癌診斷率較低，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期。近年來(lái)，胃癌發(fā)病率不斷上升，與飲食結(jié)構(gòu)、環(huán)境改變等多種因素有關(guān)[9]。胃癌的發(fā)生及進(jìn)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，多種信號(hào)通路與胃癌的發(fā)生有關(guān)。其中，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡等方面起到重要的調(diào)控作用，其可傳遞細(xì)胞有絲分裂信號(hào)，上調(diào)細(xì)胞周期素、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶等的翻譯，使細(xì)胞周期的運(yùn)行速度加快，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與分化[6,10]。胃癌細(xì)胞通常會(huì)表現(xiàn)出明顯的基因組改變，如基因異質(zhì)性的缺失、非整倍體基因、基因不穩(wěn)定，導(dǎo)致基因無(wú)法正常表達(dá)，這是胃癌細(xì)胞的自我處理所導(dǎo)致的[8]。當(dāng)一個(gè)細(xì)胞處于癌變狀態(tài)時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)的PI3K- Akt信號(hào)會(huì)增加，mTOR會(huì)被激活、細(xì)胞的反饋活動(dòng)會(huì)減少。所有這些變化會(huì)使細(xì)胞代謝增快，血管生成增加、核糖體生成增多，從而改變蛋白質(zhì)的生物結(jié)構(gòu)，進(jìn)而引起腫瘤的形成[11]。胃癌死亡率較高，即使行胃癌根治性術(shù)后，術(shù)后存活期仍較短，其預(yù)后主要與癌細(xì)胞浸潤(rùn)胃壁的深度，周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。研究[12]顯示胃癌淋巴轉(zhuǎn)移與Akt/mTOR信號(hào)通路的活化有關(guān)，Akt/mTOR信號(hào)蛋白在胃癌細(xì)胞中較正常細(xì)胞過度表達(dá)，導(dǎo)致癌細(xì)胞通過淋巴管轉(zhuǎn)移，影響患者預(yù)后。紫杉醇是臨床上較常使用的一種化療藥物，其可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，但在胃癌的治療上療效欠佳，主要是胃癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性較差導(dǎo)致。甲氟喹是人工合成的4- 喹啉-甲醇衍生物，能夠有效殺滅紅細(xì)胞內(nèi)裂殖體，主要用于治療瘧疾的藥物。研究[13]表明其良好的細(xì)胞毒性可以誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞的凋亡，在惡性腫瘤的治療中越來(lái)越受到人們的重視。本研究將甲氟喹作為胃癌治療的潛在藥物，發(fā)現(xiàn)甲氟喹可以作用于對(duì)紫杉醇不敏感的胃癌細(xì)胞株，抑制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，與紫杉醇起到協(xié)同作用。且發(fā)現(xiàn)甲氟喹可以通過抑制PI3K / Akt / mTOR信號(hào)通路磷酸化蛋白的活性從而有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

Liu et al[14]分別建立小鼠體內(nèi)、體外模型，采用不同類型的胃癌細(xì)胞研究甲氟喹對(duì)胃癌細(xì)胞的影響及作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)不同濃度的甲氟喹促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡程度不同，在一定濃度下(0.1～5 μmol/L)，隨著濃度增加，細(xì)胞凋亡越明顯；且甲氟喹聯(lián)合紫杉醇較兩者單藥使用作用于細(xì)胞株，促進(jìn)凋亡效應(yīng)更明顯，此外，發(fā)現(xiàn)甲氟喹可有效抑制胃癌細(xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路磷酸化蛋白的活性，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，先用紫杉醇分別處理兩種不同的胃癌細(xì)胞，得到對(duì)紫杉醇敏感性較低的細(xì)胞株BGC- 823，再分別用一定濃度的甲氟喹、紫杉醇、紫杉醇聯(lián)合甲氟喹處理該細(xì)胞株，與前兩者比較，發(fā)現(xiàn)甲氟喹聯(lián)合紫杉醇可明顯降低細(xì)胞株BGC- 823的增殖，促進(jìn)其凋亡。為進(jìn)一步明確甲氟喹協(xié)同紫杉醇促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，分別采用兩者單藥、兩者聯(lián)合作用胃腺癌BGC- 823細(xì)胞株24 h，檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中p- PI3K、PI3K、p- Akt、Akt、p- mTOR、mTOR蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合使用較兩者單藥能顯著抑制上述磷酸化蛋白的活性，說明兩者協(xié)同促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡是通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化蛋白的表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的，該結(jié)果與Liu et al[14]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

綜上所述，甲氟喹作為一種抗瘧藥，此實(shí)驗(yàn)將其作用于胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)甲氟喹可以作用于對(duì)紫杉醇不敏感的胃癌細(xì)胞株，抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，與紫杉醇具有協(xié)同作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明甲氟喹協(xié)同紫杉醇通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化蛋白的表達(dá)水平抑制胃癌細(xì)胞增殖，為抗胃癌新藥物的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。本研究獲得的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均在體外以細(xì)胞培養(yǎng)方式獲得，由于人體內(nèi)環(huán)境中多種因素的影響，甲氟喹聯(lián)合紫杉醇對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用機(jī)制還需要在動(dòng)物模型中進(jìn)一步深入研究。