戴永錚，錢成煒，徐小立，蔣 勇

口腔鱗狀細(xì)胞癌復(fù)發(fā)率高、生存周期短，手術(shù)治療的局限性造成治療效果差，因而新的治療方法對(duì)提高患者生存率具有重要意義。電壓門控鈉離子通道(voltage- gated sodium channel，VGSC)是一種跨膜糖蛋白，由一個(gè)α亞基和多個(gè)β亞基組成。根據(jù)α亞基的不同可將其分為9種，即Nav1.1- Nav1.9[1]。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)， Nav1.5在包括前列腺癌[2]、乳腺癌[3]、卵巢癌[4]、宮頸癌[5]和非小細(xì)胞肺癌[6]等多種腫瘤中高表達(dá)，對(duì)腫瘤的增殖、侵襲等生物學(xué)過程具有明顯的調(diào)節(jié)作用。在口腔鱗癌中，研究[7]顯示Nav1.5在癌組織中的表達(dá)相比正常組織明顯升高，但其在口腔鱗癌中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究甚少。該研究通過檢測Nav1.5的表達(dá)水平變化以及在增殖和侵襲中具有重要作用的相關(guān)蛋白檢測，來分析其對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用，為口腔鱗癌的靶向治療尋求新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自以色列Biolnd公司；胰酶消化液、細(xì)胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、 RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Nav1.5多克隆抗體購自美國Abcam公司；基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP- 2)、 MMP- 9多克隆抗體購自美國santa cruz公司；山羊抗鼠、抗兔IG抗體購自北京中杉金橋公司；CCK8試劑盒購自日本同仁公司；PCR引物購自上海生物工程股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time- PCR，RT- PCR)試劑盒購自日本Takara公司； PVDF 膜購自美國Invitrogen公司；Matrigel膠、Transwell小室購自美國Corning公司；siRNA- Nav1.5購自上海吉瑪公司；lipo2000、CO2恒溫孵箱購自美國Thermo Fisher公司；RT- PCR儀購自美國Stratagene公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio- tek公司。收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科口腔鱗癌組織(2例)和正?？谇火つそM織(牙齦2例)，標(biāo)本取下直接保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1組織免疫組化 4%甲醛固定組織6 h，石蠟包埋，4 μm厚切片，60 ℃烤片4 h，脫蠟至水，抗原修復(fù)，3% H2O2室溫孵育10 min，1 ∶200稀釋Nav1.5一抗4 ℃孵育過夜(16 h左右)，HRP二抗37 ℃、 30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片，鏡下觀察。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) HSC- 3細(xì)胞在含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素DMEM培養(yǎng)基中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3 d傳代一次。

1.2.3免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞以5×105個(gè)/ml的密度接種于共聚焦小皿，孵箱過夜。4%多聚甲醛室溫下固定30 min，0.5% Trixton X- 100室溫下穿通20 min，1% BSA封閉細(xì)胞30 min， 加入Nav1.5的一抗(6 μg/ ml)冰箱孵育24 h，次日室溫孵育1 h。 加入羅丹明標(biāo)記的二抗(1 ∶50)避光孵育2 h，DAPI(1 ∶2 000)避光孵育8 min。在Zeiss LSM510共聚焦成像系統(tǒng)下觀察細(xì)胞。

1.2.4siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)上查找Nav1.5的序列，根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)合成3條Nav1.5的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)組，以及一條陰性對(duì)照(negative control，NC)組，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照(control，CON)組，序列見表1。轉(zhuǎn)染前1 d，將2×105個(gè)/ml細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，每孔中加入約500 μl無抗生素的培養(yǎng)基。取1 μl/孔lipo2000，用50 μl opti- MEM無血清培養(yǎng)基稀釋，并室溫孵育5 min。取2 μl siRNA，以50 μl opti- MEM無血清培養(yǎng)基稀釋，混勻。2種液體輕輕混勻，室溫靜置20 min。加入含有細(xì)胞及培養(yǎng)液的孔中，混勻。轉(zhuǎn)染6 h后，換為含血清的完全培養(yǎng)基。見表1。

1.2.5RT- PCR檢測 按TRIzol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，使用PrimeScriptTM- PCR kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以此為模板，用目標(biāo)基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。反應(yīng)條件：95 ℃、1 min，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，PCR的所有引物均由上海生物工程公司進(jìn)行設(shè)計(jì)合成，序列見表2。

表2 引物序列

1.2.6Western blot 檢測 用RIPA細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白。BCA試劑盒測定各組蛋白濃度，調(diào)整各組濃度一致后，99 ℃、10 min使蛋白變性，SDS- PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至0.45 μm的PVDF膜上，5% BSA封閉，一抗、二抗孵育，經(jīng)ECL曝光成像。

1.2.7Transwell實(shí)驗(yàn) Matrigel膠與DMEM培養(yǎng)基按1 ∶9混勻制成稀釋液。小室濾膜均勻涂抹50 μl稀釋液，37 ℃、5% CO2恒溫箱滯留2 h。取3組培養(yǎng)24 h細(xì)胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液得下層細(xì)胞，DMEM重懸計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)為1×106個(gè)/ml。上室加細(xì)胞懸液各100 μl，下室加600 μl 20% FBS的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2恒溫箱孵育24 h，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取出小室，吸出上室培養(yǎng)液，擦凈上室表面Matrigel膠，4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色20 min，晾干，拍照，200倍顯微鏡下計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.8CCK8檢測細(xì)胞增殖活性 待檢測細(xì)胞計(jì)數(shù)，并鋪于96孔板。確定細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h使其貼壁緊密。96孔板每個(gè)孔加10 μl CCK8溶液，在培養(yǎng)箱孵育1 h，顯色反應(yīng)后，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值(optical density，OD)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。根據(jù)OD450值繪制12 、24 、48 、72 h柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 組織和細(xì)胞中Nav1.5的表達(dá)臨床收集的正?？谇火つそM織和口腔鱗癌組織做免疫組化，光鏡下觀察組織中Nav1.5蛋白表達(dá)情況，癌組織中于細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)中出現(xiàn)不同程度的棕黃深染，即Nav1.5蛋白呈陽性表達(dá)，在正?？谇火つそM織中幾乎看不到棕黃色，見圖1。HSC- 3細(xì)胞中免疫熒光染色激光共聚焦鏡下觀察，在胞質(zhì)和胞膜上可見熒光標(biāo)記的Nav1.5呈紅色，胞核呈藍(lán)色，Nav1.5在HSC- 3細(xì)胞中陽性表達(dá)，見圖2。

圖1 免疫組化法檢測Nav1.5蛋白的表達(dá) ×100A：正常組織染色陰性；B：癌組織染色陽性

圖2 免疫熒光法檢測HSC- 3細(xì)胞中Nav1.5的表達(dá) ×200

A：細(xì)胞核的染色呈藍(lán)色；B：Nav1.5蛋白的染色呈紅色； C：A和B的合成圖

2.2 HSC- 3細(xì)胞Nav1.5的沉默效率FAM標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染HSC- 3細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞，與明場視野下對(duì)比，轉(zhuǎn)染效率較高。RT- PCR和Western blot 結(jié)果顯示與CON組比較，S1、S2和S3組Nav1.5的mRNA表達(dá)均有所下調(diào)，S2和S3組下調(diào)較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CON組和NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。因此以下實(shí)驗(yàn)均采用S3轉(zhuǎn)染。

2.3 Nav1.5對(duì)HSC- 3細(xì)胞增殖和侵襲的影響CCK8檢測干擾后的細(xì)胞在450 nm處OD值，測量結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染48 h后siRNA組(1.31±0.21)與CON組(1.06±0.22)和NC組(0.67±0.09)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.006，P<0.01)，CON組和NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，siRNA組(7.33±1.55)與CON組(55.0±3.00)和NC組(47.0±4.00)比較，穿過小室細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=222.7，P<0.001)，CON組和NC之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

圖3 經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后Nav1.5沉默效率

A：轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記siRNA明場視野下；B：同一視野下熒光觀察×200；C：轉(zhuǎn)染后各組Nav1.5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平；與CON組比較：**P<0.01；D：轉(zhuǎn)然后各組Nav1.5蛋白表達(dá)水平；S1、S2和S3分別代表轉(zhuǎn)染不同序列siRNA- Nav1.5

圖4 經(jīng)siRNA干擾后HSC- 3細(xì)胞OD450值比較

2.4 RT- PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染siRNA- Nav1.5對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響經(jīng)siRNA- Nav1.5轉(zhuǎn)染后的HSC- 3細(xì)胞內(nèi)PCNA、MMP- 2和MMP- 9基因水平表達(dá)和蛋白水平表達(dá)均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.12、22.89、11.72，P<0.05)，見表3和圖6、7。

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌作為頜面部最常見的惡性腫瘤，常常發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，晚期可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅著人類的健康。為了克服傳統(tǒng)手術(shù)加放化療治療方法的弊端，分子靶向治療越來越重要。為了尋找更為有效的治療靶點(diǎn)，在本課題組的早期研究中，劉偉佳 等[7]發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，Nav1.5的表達(dá)與正常組織相比顯著提高，本研究免疫組化結(jié)果也得到證實(shí)。此外，Nav1.5的表達(dá)與組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這提示著Nav1.5有望成為口腔鱗癌治療的新靶點(diǎn)。

圖5 經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后HSC- 3細(xì)胞侵襲性比較 ×200

A：CON組；B：NC組；C：siRNA組; 與CON組比較：***P<0.001；與NC組比較：###P<0.001

表3 轉(zhuǎn)染siRNA及空白組相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)量

與CON組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； 與NC組比較：#P<0.05，##P<0.01

近年來，越來越多的研究[8-11]發(fā)現(xiàn)Nav1.5與癌癥密切相關(guān)，并表明Nav1.5在癌癥增殖轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。Mohammed et al[8]研究顯示Nav1.5在高侵襲性乳腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)和核周區(qū)域以及板狀偽足中表達(dá)。本研究免疫熒光共焦顯微鏡的結(jié)果顯示HSC- 3細(xì)胞中也有著相同分布。為探討Nav1.5對(duì)HSC- 3細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，本研究對(duì)HSC- 3細(xì)胞進(jìn)行siRNA- Nav1.5干擾實(shí)驗(yàn)，RT- PCR和Western blot檢測干擾后HSC- 3細(xì)胞中Nav1.5出現(xiàn)明顯下調(diào)后再分別進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和CCK8檢測干擾后細(xì)胞增殖OD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)siRNA- Nav1.5干擾后的HSC- 3細(xì)胞的增殖和侵襲能力顯著下降。說明Nav1.5在口腔鱗癌細(xì)胞生物學(xué)特性方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。在乳腺癌的研究[9]中也有著相似的結(jié)果，沉默Nav1.5基因后，MDA- MB- 231細(xì)胞的侵襲能力顯著降低。在結(jié)腸癌中，研究[10]表明Nav1.5基因涉及廣泛的信號(hào)調(diào)節(jié)并參與腫瘤細(xì)胞侵襲的調(diào)節(jié)，是癌細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子。在動(dòng)物體內(nèi)研究[11]中，發(fā)現(xiàn)敲低Nav1.5顯著抑制了腫瘤的生長和體內(nèi)局部侵襲。盡管證明了Nav1.5在口腔鱗狀細(xì)胞癌的生長和轉(zhuǎn)移中起重要作用，但其具體機(jī)制尚不清楚。

PCNA與細(xì)胞的DNA合成密切相關(guān)，在細(xì)胞的增殖中起關(guān)鍵作用，也是細(xì)胞異常增殖的關(guān)鍵蛋白，有研究[12]表明，相比正?？谇唤M織在口腔鱗狀細(xì)胞癌中PCNA過表達(dá)，提示其與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，RT- PCR和Western blot結(jié)果顯示經(jīng)siRNA- Nav1.5轉(zhuǎn)染的HSC- 3細(xì)胞內(nèi)PCNA表達(dá)下降。對(duì)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解是腫瘤侵蝕正常組織并引發(fā)轉(zhuǎn)移的重要途徑。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase ，MMPs)是最重要的，可以降解ECM的所有成分，近年來已成為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移研究的熱點(diǎn)，其中又以MMP- 2和MMP- 9最為重要。Chandolia et al[13]研究發(fā)現(xiàn)：相比正?？谇火つど掀?，口腔鱗癌中MMP- 9表達(dá)水平顯著提高。在本實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染siRNA- Nav1.5 48 h后HSC- 3細(xì)胞內(nèi)MMP- 2和MMP- 9表達(dá)均下調(diào)。以上結(jié)果說明口腔鱗癌中Nav1.5可能通過直接或間接地調(diào)控PCNA、MMP- 2和MMP- 9的表達(dá)進(jìn)而影響著細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。

圖6 RT- PCR檢測MMP- 2、MMP- 9和PCNA mRNA表達(dá)

A：MMP- 2 mRNA相對(duì)表達(dá)量； B：MMP- 9 mRNA相對(duì)表達(dá)量； C：PCNA mRNA相對(duì)表達(dá)量；與CON組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； 與NC組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖7 Western blot檢測干擾后HSC- 3細(xì)胞PCNA、MMP- 2和MMP- 9蛋白的表達(dá)變化

與CON組比較：*P<0.05； 與NC組比較：#P<0.05

為了進(jìn)一步研究證明動(dòng)物體內(nèi)Nav1.5的生物學(xué)作用，下一步將進(jìn)行裸鼠皮下造瘤后的進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從而推進(jìn)Nav1.5作為臨床口腔鱗癌治療靶點(diǎn)的應(yīng)用。