王 璐，王 愛，楊 瑞，張瑩瑩，倪 欣，于秀石，單莉婭，馬克濤

炎癥反應(yīng)是常見的一個病理過程，當(dāng)機(jī)體免疫反應(yīng)狀態(tài)異常時，可有大量淋巴細(xì)胞浸潤，造成組織和細(xì)胞損傷而導(dǎo)致炎癥，淋巴細(xì)胞作為反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)在其中發(fā)揮著必不可少的作用[1]。課題組前期研究[2-3]表明，應(yīng)用縫隙連接阻斷劑(gap junction inhibitory peptide，Gap27)后炎癥因子的釋放被顯著抑制，提示由連接蛋白(connexin，Cx)構(gòu)成的縫隙連接通道在淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。有研究[4-5]表明，縫隙連接通道介導(dǎo)免疫細(xì)胞間的電和化學(xué)信號交流，參與細(xì)胞因子的釋放以及炎癥反應(yīng)過程。近年研究[6-7]顯示，雌激素(estrogen，E)除了可以促進(jìn)和維持女性生殖器官和第二性征的發(fā)育以外，也通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)。因此，該研究假設(shè) E抑制炎癥反應(yīng)可能與淋巴細(xì)胞間連接蛋白的表達(dá)以及炎癥因子的釋放有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

1.1.1試劑 ConA和E購自美國Sigma公司；APC anti- rat CD4和Per- cp anti- rat CD8a購自美國Biolegend公司；Anti- Connexin 40購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；Anti- Connexin 43 抗體購自美國Abcam公司；Cx 40 FITC標(biāo)記二抗和Cx 43 FITC標(biāo)記二抗購自北京中杉金橋生物公司；KBM581培養(yǎng)基購自美國Corning公司；大鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL- 1β)、IL- 6 ELISA檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)罂萍加邢挢?zé)任公司。

1.1.2儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱購自上海力申科學(xué)儀器有限公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；LSM510激光共聚焦顯微鏡購自德國CarlZeiss公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)動物選取12周齡清潔級WKY雄鼠6只，體質(zhì)量150～300 g，飼養(yǎng)環(huán)境的室溫控制在22～25 ℃、濕度50%～60%，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，動物合格證號：SCXK(京)2012- 0001。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 大鼠稱重，麻醉，采集腹主動脈血，3 500 r/min離心10 min，棄上清液，剩余血細(xì)胞根據(jù)密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，于細(xì)胞間超凈臺無菌操作將分離的白色云霧狀淋巴細(xì)胞層吸出，細(xì)胞洗滌液洗滌2次，紅細(xì)胞裂解液裂解1次，1 800 r/min離心6 min，棄上清液，沉淀加入10%胎牛血清的KBM581進(jìn)行培養(yǎng)。分為三組：空白組(Ctrl)、ConA組(10 μg/ml ConA干預(yù)48 h)和ConA+E組(1 μg/ml E預(yù)孵育24 h后加入10 μg/ml ConA共孵育48 h)。

1.3.2ELISA檢測培養(yǎng)基中IL- 1β和IL- 6水平 取出已干預(yù)好的細(xì)胞，1 800 r/min離心6 min，取上清液，應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測IL- 1β和IL- 6水平，操作步驟按照試劑盒說明書。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43的表達(dá)水平 取出已干預(yù)好的細(xì)胞，1 800 r/min離心6 min，棄上清液，PBS重懸細(xì)胞，設(shè)置陰性對照管和同型對照管，按照說明書分別加入相應(yīng)流式表面抗體APC- CD4和 percp- CD8a，充分混勻后室溫避光孵育 30 min，洗滌后1 800 r/min離心6 min，棄上清液；固定破膜后分別孵育Cx40和Cx43一抗及二抗，37 ℃孵育30 min；洗滌后加入PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)進(jìn)行流式檢測。

1.3.4免疫熒光技術(shù)檢測淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43的表達(dá)及分布情況 取出已干預(yù)好的細(xì)胞，1 800 r/min離心6 min，棄上清液，PBS漂洗3次，固定，破膜，BSA 37 ℃封閉30 min，一抗于濕盒內(nèi)37 ℃孵育2 h，PBS漂洗3次，二抗于濕盒內(nèi)37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3次，滴加PI，濕盒內(nèi)室溫避光染色20 s，PBS漂洗3次，封片。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.5Western blot檢測淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43的蛋白表達(dá) 取出已干預(yù)好的細(xì)胞，1 800 r/min離心6 min，沉淀采用BCA法測定蛋白濃度后，取蛋白樣品加入適量的上樣緩沖液，置于沸水中使蛋白變性，于SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，電泳完畢后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于含5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h，分別加入Cx40、Cx43及NADPH一抗4 ℃過夜，洗膜后再加入二抗室溫孵育2 h，再次洗膜后與發(fā)光試劑反應(yīng)，置于X線膠片暗盒中曝光、顯影。應(yīng)用ImageJ2x分析軟件檢測并分析條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基中IL- 1β及IL- 6的水平ELISA檢測結(jié)果顯示，ConA組與Ctrl組相比，培養(yǎng)基中IL- 1β 和IL- 6水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；ConA+E組與ConA組相比，培養(yǎng)基中IL- 1β和IL- 6水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05，n=6)，見表1。

表1 培養(yǎng)基中IL- 1β及IL- 6的水平

與Ctrl組比較：**P<0.01；與ConA組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.2 淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43的表達(dá)及分布差異采用FITC染料標(biāo)記二抗和PI標(biāo)記細(xì)胞核的雙重免疫熒光來顯示Cx40和Cx43在淋巴細(xì)胞上的表達(dá)和分布情況。綠色熒光代表Cx40和Cx43在淋巴細(xì)胞上的表達(dá)和分布情況，而紅色熒光則對應(yīng)為染色的細(xì)胞核。結(jié)果表明，Cx40主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，而Cx43主要表達(dá)在細(xì)胞膜，與Ctrl組相比，ConA組Cx40和Cx43在淋巴細(xì)胞上表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，給予E干預(yù)后Cx40和Cx43的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

2.3 淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43表達(dá)水平的變化流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，ConA組淋巴細(xì)胞Cx40和Cx43陽性表達(dá)率高于Ctrl組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；ConA+E組淋巴細(xì)胞Cx40和Cx43陽性表達(dá)率低于ConA組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，n=3)，見圖2。

2.4 淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43的蛋白表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示，ConA組淋巴細(xì)胞上Cx40蛋白表達(dá)水平高于Ctrl組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；ConA+E組淋巴細(xì)胞上Cx40蛋白表達(dá)水平低于ConA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

ConA組淋巴細(xì)胞上Cx43蛋白表達(dá)水平明顯高于Ctrl組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；ConA+E組淋巴細(xì)胞上Cx43蛋白表達(dá)水平明顯低于ConA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

3 討論

炎癥反應(yīng)是機(jī)體活組織對各種致炎因素的一種正常防御反應(yīng)，同時伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤，這方面變化產(chǎn)生的實(shí)質(zhì)是機(jī)體與炎癥因子進(jìn)行抗?fàn)幍姆从砙8]。炎癥因子主要由免疫細(xì)胞釋放，在炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[9]。其中， IL- 1β和IL- 6能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖與分化，促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)。同時，淋巴細(xì)胞在免疫反應(yīng)中也發(fā)揮核心作用，其活化、增殖及炎癥因子的釋放等細(xì)胞行為是免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵事件[10]。另外，ConA具有強(qiáng)力的促有絲分裂作用，能夠較好的促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，刺激淋巴細(xì)胞分泌炎癥因子[11]。本研究結(jié)果表明，通過ELISA檢測炎癥因子表達(dá)水平，使用ConA激活淋巴細(xì)胞后，淋巴細(xì)胞釋放IL- 1β 和IL- 6增多，給予雌激素干預(yù)后，IL- 1β和IL- 6的濃度明顯降低，提示體外炎癥模型制備成功，并且E能夠減少ConA刺激下炎癥因子的分泌。

圖1 淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43的表達(dá)及定位 ×630

圖2 淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43的表達(dá)水平

A：淋巴細(xì)胞上Cx40陽性表達(dá)及統(tǒng)計結(jié)果；B：淋巴細(xì)胞上Cx43陽性表達(dá)及統(tǒng)計結(jié)果;與Ctrl組比較：*P<0.05,**P<0.01；與ConA組比較：#P<0.05

圖3 淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43的蛋白表達(dá)

由Cx構(gòu)成的縫隙連接通道作為細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交換和信息通訊的一種特殊膜通道結(jié)構(gòu)，直接介導(dǎo)細(xì)胞間的電和化學(xué)信號交流，在細(xì)胞增殖分化以及機(jī)體新陳代謝中發(fā)揮重要作用。Vliagoftis et al[5]發(fā)現(xiàn)Cx43在外周血嗜酸性粒細(xì)胞上表達(dá)，不僅定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而且存在于質(zhì)膜上。本研究結(jié)果證實(shí)了淋巴細(xì)胞上表達(dá)有Cx40和Cx43，且Cx40主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，而Cx43主要表達(dá)在細(xì)胞膜。此外，研究[12]顯示由Cx40和Cx43構(gòu)成的縫隙連接通道參與免疫系統(tǒng)細(xì)胞間細(xì)胞通訊及免疫炎癥應(yīng)答。當(dāng)免疫細(xì)胞受到炎癥因子的刺激時，淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43表達(dá)可顯著上調(diào)。本研究結(jié)果中也表明由ConA激活的淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43的表達(dá)升高，提示Cx40和Cx43可能參與了炎癥反應(yīng)。近年來研究[13]顯示，E可以抑制炎癥反應(yīng)，對多種臟器具有一定的保護(hù)作用。已有研究[14]表明，E對多種組織細(xì)胞中Cx43的表達(dá)、分布、空間構(gòu)象及功能狀態(tài)等具有調(diào)節(jié)作用，且具有調(diào)節(jié)縫隙連接的功能。本研究結(jié)果顯示，在ConA刺激下淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43的表達(dá)上調(diào)，給予E干預(yù)后，淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43的表達(dá)下降，提示E的抗炎作用可能與下調(diào)淋巴細(xì)胞上的連接蛋白有關(guān)，但它是如何通過下調(diào)淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43從而發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制仍不十分清楚，后續(xù)需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43的表達(dá)在ConA刺激下顯著上調(diào)，炎癥因子水平升高，給予E進(jìn)行干預(yù)后，Cx40和Cx43的表達(dá)下降，炎癥因子水平降低，表明E能夠抑制促炎因子IL- 1β 和IL- 6的釋放，同時下調(diào)淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43的表達(dá)，從而改善炎癥反應(yīng)。這一研究對了解Cx參與淋巴細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有一定的意義，也為闡明E的抗炎機(jī)制及其臨床治療提供更多依據(jù)。