張 梅，束 軍，朱 寧，沈繼龍

肺癌是當(dāng)今世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居所有惡性腫瘤之首。己糖激酶(hexokinase 2, HK2)是糖酵解過(guò)程中的第一個(gè)限速酶，在糖酵解途徑中起著關(guān)鍵性的作用。文獻(xiàn)表明HK2在各種類型的腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤的轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的，其中基質(zhì)金屬蛋白9(matrix metalloproteinase 9,MMP- 9)介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)的降解對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有重要意義[1]。Vimentin參與細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。3- 溴丙酮酸(3- bromopyruvate，3- BrPA)是HK2抑制劑，可以通過(guò)抑制HK2從而抑制肺腺癌細(xì)胞增殖以及促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡。然而3- BrPA對(duì)肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響的相關(guān)研究還較少。因此，該研究旨在觀察不同濃度3- BrPA對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力及MMP- 9和Vimentin表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器3- 溴丙酮酸(美國(guó)Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO)、RPMI- 1640培養(yǎng)基 (美國(guó)HyClone公司)、胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)，Transwell小室、Matrigel膠(美國(guó)Corning公司)，己糖激酶檢測(cè)試劑盒(南京建成公司)，ELISA試劑盒(武漢基因美科技有限公司)。酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海天平儀器廠)，超低溫冰箱(日本Sanyo公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)含10%胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.3 劃痕實(shí)驗(yàn)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞，重懸并調(diào)整其密度為2×105/ml并種植到6孔板，每孔2 ml，待融合度達(dá)90%時(shí)，用100 μl移液器槍尖在六孔培養(yǎng)板上垂直于板底面劃出距離0.5～1.0 cm的五條平行直線，去除舊培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS洗2次，加入2 ml無(wú)血清培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察拍照，為0 h的劃痕寬度。再加入PBS溶解的3- BrPA使其終濃度分別為35、70、140 μmol/L，此為干預(yù)組，不加3- BrPA干預(yù)的為陰性對(duì)照組(0 μmol/L 3- BrPA組)，每組3個(gè)副孔，分別于12 h和24 h在顯微鏡下觀察拍照。用Image- pro plus 6.0軟件計(jì)算劃痕寬度，細(xì)胞遷移距離=0 h距離-12 h/24 h距離。

1.4 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞鋪6孔板培養(yǎng)24 h后，分別加入0、35、70、140 μmol/L的3- BrPA，每組3個(gè)副孔，分別作用于A549細(xì)胞6 h，常規(guī)消化，1 000 r/min 離心5 min后無(wú)菌PBS洗1次再離心1次，后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸并調(diào)整各組細(xì)胞密度為2×106/ml，取100 μl細(xì)胞懸液輕輕加入Transwell小室上室，下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后。棄去上室內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗2次后用棉簽輕輕擦去上室表面未穿過(guò)的細(xì)胞，4 %多聚甲醛固定30 min，晾干后用0.1%結(jié)晶紫染色約30 min，晾干，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照(20倍鏡下拍照，40倍鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù))。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野/孔,計(jì)數(shù)穿過(guò)小室底膜的細(xì)胞數(shù)，取平均值作為結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)取分裝后的Martigel膠冰上融化，無(wú)血清培養(yǎng)基4 ℃冰箱預(yù)冷。融化后的Martigel膠用預(yù)冷后的無(wú)血清培養(yǎng)基按1 ∶8比例稀釋。在Transwell小室上室底部加入50 μl稀釋后的Martigel膠，注意鋪滿鋪勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱待膠凝固，每個(gè)小室再加入50 μl無(wú)血清培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱30 min水化基底膜，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.6 己糖激酶活性測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞(2×106/ml)分別加入含3- BrPA 0、35、70、140 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞懸液離心后去上清留細(xì)胞沉淀，PBS洗2次加裂解液裂解至少30 min，后12 000 r/min離心20 min,留上清液作為待測(cè)樣本。再按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，按照公式計(jì)算酶活性。HK活性(U/g)=(A2-A1)/毫摩爾消光系數(shù)/(反應(yīng)時(shí)間×比色光徑)×反應(yīng)體系中樣本稀釋倍數(shù)/勻漿蛋白濃度(g/ml)。A1：30 s時(shí)讀取的光密度值，A2：150 s時(shí)讀取的光密度值。

1.7 ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液及細(xì)胞內(nèi)MMP- 9、Vimentin蛋白的濃度按1.4同樣方法制備待測(cè)樣本后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)并計(jì)算相應(yīng)蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3- BrPA抑制A549細(xì)胞的遷移0、35、70、140 μmol/L 3- BrPA組的24 h 遷移距離分別為(75.02±7.15)、(67.01±4.52)、(42.92±2.25)、(10.69±1.58)μm。與0 μmol/L 3- BrPA組相比，各濃度3- BrPA干預(yù)組遷移距離明顯減少，且隨著3- BrPA濃度的增加，遷移距離逐漸減少，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=249.7,P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度3- BrPA對(duì)A549細(xì)胞遷移力的影響 ×20

A：0 μmol/L 3- BrPA組；B～D：分別為 35、70、140 μmol/L 3- BrPA處理組；1：0 h；2：24 h；與0 μmol/L 3- BrPA組比較：*P<0.05；與35 μmol/L 3- BrPA處理組比較：#P<0.05；與70 μmol/L 3- BrPA 處理組比較：△P<0.05

2.2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3- BrPA抑制A549細(xì)胞的遷移與0 μmol/L 3- BrPA組相比，各濃度3- BrPA干預(yù)組遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少，且隨著3- BrPA濃度的增加，遷移細(xì)胞數(shù)逐漸減少，各干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3- BrPA抑制A549細(xì)胞的侵襲與0 μmol/L 3- Br- PA組相比，各濃度3- BrPA干預(yù)組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，且隨著3- BrPA濃度的增加，侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少，各干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 3- BrPA抑制己糖激酶活性與0 μmol/L 3- BrPA組相比，各濃度3- BrPA干預(yù)組HK活性明顯降低，且隨著3- BrPA濃度的升高，HK2活性逐漸降低，各干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=136.5,P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖2 不同濃度3- BrPA處理的A549細(xì)胞遷移能力的比較 ×20

A、B、C、D：0、35、70、140 μmol/L 3- BrPA；與0 μmol/L 3- BrPA組比較:*P<0.05；與35 μmol/L 3- BrPA處理組比較:#P<0.05；與70 μmol/L 3- BrPA處理組比較:△P<0.05

2.5 ELISA法檢測(cè)3- BrPA抑制A549細(xì)胞內(nèi)外MMP- 9、Vimentin的表達(dá)隨著3- BrPA濃度增加，MMP- 9、Vimentin濃度逐漸降低。不同濃度3- BrPA干預(yù)組間細(xì)胞培養(yǎng)上清MMP- 9(F=171.1,P<0.05)、Vimentin(F=122.3,P<0.05)及細(xì)胞內(nèi)MMP- 9(F=145.6,P<0.05)、Vimentin(F=143.6,P<0.05)的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5、6。

3 討論

目前肺癌發(fā)病率和死亡率居世界惡性腫瘤之首，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移作為惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征，是腫瘤患者死亡的主要原因，因此阻止肺癌的轉(zhuǎn)移顯得尤為重要。

圖3 不同濃度3- BrPA處理的A549細(xì)胞侵襲能力的比較 ×20

A～D：0、35、70、140 μmol/L 3- BrPA；與0 μmol/L 3- BrPA組比較:*P<0.05；與35 μmol/L 3- BrPA 處理組比較:#P<0.05；與70 μmol/L 3- BrPA 處理組比較:△P<0.05

圖4 不同濃度的3- BrPA處理對(duì)A549細(xì)胞HK活力的影響

與0 μmol/L 3- BrPA組比較：*P<0.05；與35 μmol/L 3- BrPA處理組比較：#P<0.05；與70 μmol/L 3- BrPA處理組比較：△P<0.05

圖5 不同濃度3- BrPA對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)、外MMP- 9含量的影響

上清液中MMP- 9含量與0 μmol/L 3- BrPA組比較：*P<0.05；細(xì)胞內(nèi)MMP- 9含量與0 μmol/L 3- BrPA組比較：#P<0.05

圖6 不同濃度3- BrPA對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)、外Vimentin含量的影響

上清液中Vimentin含量與0 μmol/L 3- BrPA組比較：*P<0.05；細(xì)胞內(nèi)Vimentin含量與0 μmol/L 3- BrPA組比較：#P<0.05

己糖激酶是腫瘤細(xì)胞主要代謝表型—Warburg效應(yīng)的第一個(gè)限速酶，其中, HK2是主要的異構(gòu)體， HK2在癌細(xì)胞中是高表達(dá)的。許多文獻(xiàn)表明高水平的HK2在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。國(guó)內(nèi)外許多文獻(xiàn)證實(shí)抑制HK2活性能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長(zhǎng)[2-3]。近年來(lái)，相繼也已經(jīng)有許多文獻(xiàn)證實(shí)抑制腫瘤細(xì)胞HK2的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲及對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移也有抑制作用[4-5]。如Wang et al[6]利用小干擾RNA技術(shù)敲低人舌鱗癌UM1細(xì)胞的HK2基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，敲低了HK2基因的UM1細(xì)胞的Slug和Vimentin蛋白表達(dá)量明顯減少，UM1細(xì)胞的遷移、侵襲能力明顯降低。Geng et al[7]在73例肝癌及癌旁組織的實(shí)驗(yàn)中，用小干擾RNA技術(shù)干擾HK2的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低HK2后的肝癌細(xì)胞MHCC- 97的E- cadherin和Vimentin的表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞的遷移、侵襲能力明顯受到抑制。

3- BrPA是一種強(qiáng)烷化劑，它在許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)可以通過(guò)抑制HK2的表達(dá)從而顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，最終殺死腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤生長(zhǎng)[8-9]。如Jiang et al[10]在18只移植VX2肝腫瘤兔的研究中證實(shí)經(jīng)肝動(dòng)脈3- BrPA灌注能夠減少兔VX2肝腫瘤的轉(zhuǎn)移并可延長(zhǎng)移植VX2肝腫瘤兔的生存時(shí)間； Vossen et al[11]在20只兔VX2肝細(xì)胞癌模型的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與手術(shù)癌灶切除和腫瘤血管栓塞治療方法相比，3- BrPA肝動(dòng)脈灌注治療在抑制轉(zhuǎn)移方面更有利。 Buijs et al[12]在人乳腺癌MDA- MB- 231細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)中，用RT- PCR技術(shù)和明膠酶譜法發(fā)現(xiàn)，經(jīng)3- BrPA作用24 h后的MDA- MB- 231細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞分泌的MMP- 9水平明顯降低，且呈一定的濃度依賴性。 Attia et al[13]在人乳腺癌的研究中顯示3- BrPA 能夠在體外抑制VEGF、MMP- 2和MMP- 9等的表達(dá)抑制人乳腺癌MCF- 7和T47D細(xì)胞的遷移侵襲，在體內(nèi)抑制小鼠乳腺癌模型的轉(zhuǎn)移。本研究中用ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3- BrPA處理顯著降低了轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白Vimentin及MMP- 9的表達(dá)水平。

綜上，3- BrPA處理能夠顯著抑制肺腺癌A549細(xì)胞內(nèi)HK2活性，減少A549細(xì)胞內(nèi)外轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白Vimentin及MMP- 9的表達(dá)水平，阻斷了A549細(xì)胞的遷移、侵襲。聯(lián)系前期已有的國(guó)內(nèi)外研究證明在抑制腫瘤生長(zhǎng)的劑量下的3- BrPA能夠顯著抑制A549細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡和壞死，但對(duì)正常組織細(xì)胞影響較小，具有較高的安全性，如研究[14]發(fā)現(xiàn)8 mg/kg 3- BrPA很好地抑制了裸鼠和昆明鼠皮下人乳腺癌MDA- MB- 231細(xì)胞的種植腫瘤的生長(zhǎng)而對(duì)鼠的肝、腎組織無(wú)損傷作用等。結(jié)合本研究結(jié)果3- BrPA抑制肺癌A549細(xì)胞的遷移和侵襲，呈一定程度濃度依賴性?？梢猿醪酵普?- BrPA具有限制肺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的雙重效果，有望成為可延長(zhǎng)肺腺癌患者的生存時(shí)間，提高患者的生活質(zhì)量，乃至治療肺癌的新途徑。但是，本實(shí)驗(yàn)只能初步說(shuō)明3- BrPA抑制A549細(xì)胞遷移侵襲的現(xiàn)象以及降低HK2活性、MMP- 9與Vimentin的表達(dá)，其深層機(jī)制需要進(jìn)一步深入探究。另外，實(shí)驗(yàn)僅涉及細(xì)胞層面，3- BrPA能否在體內(nèi)抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，有待進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。