夏月勝，楊麗萍，曹川，許莉，韋冬梅，隋棠，周裔彬

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥，230036)

油果是我國民間的一種以糯米為原料的傳統(tǒng)油炸膨化小吃，口感酥脆，外黃內(nèi)白，內(nèi)部呈均勻的蜂窩結(jié)構(gòu)。油果的傳統(tǒng)加工方式為長時(shí)間自然發(fā)酵糯米，發(fā)酵時(shí)間長，發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生刺鼻的臭味，而通過酵母菌發(fā)酵糯米粉能夠縮短糯米油果的生產(chǎn)周期，改善油果的食用品質(zhì)。淀粉作為谷物的主要成分，其結(jié)構(gòu)的變化直接影響著產(chǎn)品的品質(zhì)，研究淀粉結(jié)構(gòu)的變化對改善以淀粉為基質(zhì)的谷物類食品的品質(zhì)有著重要意義[1]。近年來國內(nèi)外有很多關(guān)于谷物發(fā)酵對淀粉結(jié)構(gòu)影響方面的報(bào)道，高粱中的淀粉經(jīng)自然發(fā)酵后持水性和溶解性增加，但透明度降低，糊化溫度降低，糊化焓增加，淀粉的回升值與最終黏度隨發(fā)酵時(shí)間的延長先減小后增大[2]；乳酸菌發(fā)酵使大米粉中的淀粉的保水力、溶解度、凝膠的體積膨脹率均有所增加，顆粒表面遭到侵蝕，小顆粒數(shù)目增多，峰值黏度下降，糊化焓升高，結(jié)晶度有所降低[3]；利用篩選出的自然菌種發(fā)酵小米，研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵未改變淀粉的偏光十字，其淀粉顆粒表面遭到侵蝕，孔洞增多，官能團(tuán)峰位未變但是強(qiáng)度減弱，短期抗老化性能提升[4]；釀酒酵母發(fā)酵使玉米淀粉顆粒表面產(chǎn)生孔洞，結(jié)晶度先升高后降低，短程雙螺旋有序結(jié)構(gòu)未受影響，糊化溫度和糊化焓均先升高后降低[5]；酵母菌發(fā)酵糙米粉能夠使其蛋白質(zhì)、總灰分、不溶性纖維、可溶性纖維等成分的百分含量升高，降低其溶脹度、水溶性、崩解值、回升值[6]。然而，發(fā)酵對糯米粉中淀粉結(jié)構(gòu)的影響尚未見報(bào)道。

本文從鏈長分布、表觀結(jié)構(gòu)、短程有序結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)、球晶結(jié)構(gòu)、粒徑大小、表觀結(jié)構(gòu)來分析研究糯米粉經(jīng)酵母菌發(fā)酵過程中淀粉結(jié)構(gòu)的變化，從而對糯米油果的生產(chǎn)和糯米發(fā)酵的精深加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

糯米：蚌埠兄弟糧油有限公司；酵母：安琪酵母股份有限公司；其他化學(xué)試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sirion200掃描電子顯微鏡，日本日立高新技術(shù)公司；Rigaku TTR-Ⅲ X射線衍射儀，理學(xué)電機(jī)公司；IS50FT-IR光譜儀，美國尼高力儀器公司；Mastersizer3000激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；ICS-5000高效陰離子(DionexTMCarboPacTMPA200柱(1 mm×250 mm×5.5 μm))，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 糯米粉發(fā)酵及淀粉制備

取500 g糯米粉，接種3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的酵母菌菌液，加一定量的水，揉成面團(tuán)狀，置于醒發(fā)箱中37 ℃發(fā)酵0～48 h。淀粉的提取方法參照LI等[7]的方法，用稀堿浸泡分離純化發(fā)酵不同時(shí)間的糯米淀粉。

1.3.2 發(fā)酵對淀粉鏈長分布的影響

采用Dionex ICS-5000 HPAEC的儀器，配備電化學(xué)檢測器來測定不同發(fā)酵時(shí)間的糯米淀粉的鏈長分布。稱取5 mg純化干燥的淀粉，加5 mL雙蒸水，沸水浴60 min，間斷混勻；然后取2.5 mL糊化的樣品，加入125 μL CH3COONa，25 μL NaN3和5 μL異淀粉酶，38 ℃放置24 h。加入375 μL NaBH4，室溫放置24 h。取600 μL于離心管中，室溫干燥，然后溶于600 μL流動(dòng)相中，離心(12 000 r/min,10 min)，取上清上樣。流動(dòng)相為：A相：雙蒸水; B相：100 mmol/L NaOH; C相：100 mmol/L NaOH-500 mmol/L NaAC;流速：0.5 mL/min[8]。

1.3.3 發(fā)酵對淀粉短程有序結(jié)構(gòu)的影響

淀粉置于瑪瑙研缽中加入無水KBr(1∶100, g∶g)研磨成粉末狀，再用壓片機(jī)將其壓成薄的圓片狀。紅外光譜掃描模式設(shè)為ATR模式，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1[9]。

1.3.4 發(fā)酵對淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)的影響

淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)由TTR-Ⅲ X射線衍射儀測定。在40 kV和80 mA下運(yùn)行，衍射角(2θ)掃描范圍為5°～50°，步長為0.02°。遵循LOPEZ-RUBIO等[10]的方法利用PeakFit軟件(版本4.12, Systat Software Inc., SanJose, CA, USA)計(jì)算出結(jié)晶度(即結(jié)晶區(qū)的峰面積和非結(jié)晶區(qū)的面積的比值)[11]。

1.3.5 發(fā)酵對淀粉球晶結(jié)構(gòu)的影響

將淀粉配制成10 g/L的淀粉懸浮液，混合均勻，然后吸取少量滴在載玻片上，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察[12]。

1.3.6 發(fā)酵對糯米淀粉粒徑大小的影響

淀粉的粒徑用激光散射儀進(jìn)行分析，首先用純水作為分散介質(zhì)，大燒杯作為容器，將淀粉顆粒用小藥

匙緩慢加入到大燒杯至檢測器檢測到6%左右，然后進(jìn)行粒度檢測，監(jiān)測范圍為0.02～2 000 μm，記錄對應(yīng)的直徑D(0.1)、D(0.5)、D(0.9)[13]。

1.3.7 發(fā)酵對糯米淀粉表觀結(jié)構(gòu)的影響

將淀粉均勻地涂抹在透明的雙面膠帶上，然后使用離子濺射鍍膜儀在其表面進(jìn)行鍍金，再置于掃描電鏡下觀察，找具有代表性的區(qū)域觀察淀粉表面結(jié)構(gòu)，放大倍數(shù)為2 000倍。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵對淀粉鏈長分布的影響

基于鏈長的聚合度(DP)，支鏈淀粉的分支分為 4種類型，即A鏈(DP≤12)、B1鏈(DP 13～24)、B2鏈(DP 25～36) 和B3鏈(DP≥37)[14]。圖1顯示，鏈長分布結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵12、24、48 h的A鏈的比例較未發(fā)酵的分別降低了0.97%、10.02%、 8.51%，而B1鏈的比例較未發(fā)酵的分別上升了3.19%、5.25%、6.32%，B2鏈的比例較未發(fā)酵的分別升高了1.49%、2.56%、1.30%，B3鏈的比例與未發(fā)酵的相比分別增加了0.72%、5.65%、4.33%。由此可得，發(fā)酵前期支鏈淀粉A鏈(DP≤12)的比例降低，而使支鏈淀粉B鏈(DP>12)的比例升高，發(fā)酵后期支鏈淀粉B2鏈和B3鏈的水解，使得長支鏈淀粉的比例降低。這可能是由于發(fā)酵過程中，酵母菌產(chǎn)生的酶和酸等先作用于支鏈淀粉外側(cè)的非還原性末端，使其短支鏈淀粉水解，從而長支鏈淀粉的相對含量增加[15]，而在發(fā)酵后期，發(fā)酵產(chǎn)生的酸和酶等又使得支鏈淀粉的長支鏈發(fā)生水解，從而長支鏈淀粉的含量又略有下降[16]。

A-0 h;B-12 h;C-24 h;D-48 h圖1 不同發(fā)酵時(shí)間糯米淀粉的鏈長分布Fig.1 Distribution of chain length of waxy rice starch during different fermentation time

2.2 發(fā)酵對糯米淀粉結(jié)晶度的影響

X-衍射可以反映淀粉的晶體特性，如圖2所示，原淀粉與發(fā)酵糯米淀粉都是由彌散衍射峰組成，在2θ=15°、17°、18°、23°附近出現(xiàn)特征衍射峰，是典型的谷物類A型晶體，說明發(fā)酵并未改變淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。通過計(jì)算，發(fā)酵后淀粉的結(jié)晶度(無定形區(qū)與結(jié)晶區(qū)的比值)先增大，12 h最高達(dá)到28.55%，這主要是由于發(fā)酵前期，酵母菌產(chǎn)生的酶及酸等破壞了淀粉顆粒的無定形區(qū)，而后隨發(fā)酵時(shí)間的延長結(jié)晶度逐漸減小，與發(fā)酵12 h相比分別降低了4.72%、6.97%， 這是由于發(fā)酵后期酶和酸滲透到顆粒內(nèi)部，侵蝕淀粉顆粒的結(jié)晶區(qū)，從而使得結(jié)晶區(qū)的相對面積減少，結(jié)晶度降低[5]。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間糯米淀粉的X-衍射圖譜Fig.2 X-diffraction pattern of waxy rice starch during different fermentation time

2.3 發(fā)酵對淀粉短程有序結(jié)構(gòu)的影響

觀察圖3的ATR-FTIR紅外光譜不難發(fā)現(xiàn)，在400 cm-1～4 000 cm-1它們的峰位置保持不變，說明在發(fā)酵過程中糯米淀粉無新的官能團(tuán)產(chǎn)生，經(jīng)過去卷積處理后，在1 047 cm-1和1 022 cm-1處分別對應(yīng)結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)結(jié)構(gòu)，(比值強(qiáng)度1 047 cm-1/1 022 cm-1) 強(qiáng)度，用來解釋淀粉的雙螺旋有序結(jié)構(gòu)的含量。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間糯米淀粉的FTIR圖譜Fig.3 FTIR map of waxy rice starch during different fermentation time

通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，與未發(fā)酵的相比在12 h其比值，上升了0.025 7，在發(fā)酵24和48 h后(比值1 047 cm-1/1 022 cm-1)降低，較發(fā)酵12 h分別降低了0.015、0.024 5。這與X-衍射的結(jié)果變化一致，說明了發(fā)酵使淀粉的有序結(jié)構(gòu)遭到了一定的破壞。發(fā)酵前期，淀粉的非晶區(qū)域遭到水解，使得淀粉朝著有序結(jié)構(gòu)改變，而發(fā)酵后期，結(jié)晶結(jié)構(gòu)遭到破壞，使得淀粉有序結(jié)構(gòu)面積減少，比值降低[7]。

2.4 發(fā)酵對淀粉球晶結(jié)構(gòu)的影響

淀粉顆粒內(nèi)部存在結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)，在結(jié)晶區(qū)區(qū)域中淀粉分子排列高度有序，而在無定形區(qū)域淀粉分子排列呈無序狀態(tài)，這也導(dǎo)致了這兩種結(jié)構(gòu)密度及折射率存在差異，偏振光通過時(shí)會(huì)產(chǎn)生明顯的偏光十字[17]。

由圖4可以看出在偏振光下，發(fā)酵不同時(shí)間的淀粉都具有明顯的偏光十字，證明發(fā)酵使其球晶結(jié)構(gòu)無顯著性變化，說明淀粉的結(jié)晶區(qū)被破壞得較弱，可能是由于發(fā)酵產(chǎn)生的酸和酶等主要作用于淀粉的無定形區(qū)，對其結(jié)晶區(qū)的影響較小[18]。

A-0 h；B-12 h；C-24 h；D-48 h圖4 不同發(fā)酵時(shí)間的淀粉的偏光十字Fig.4 Different fermentation time of waxy rice starch granules on the morphology

2.5 發(fā)酵對糯米淀粉粒徑大小的影響

由圖5可知，原糯米淀粉有3個(gè)粒徑分布峰，在經(jīng)過發(fā)酵處理后粒徑大小在100 μm處的分布峰消失，同時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，粒徑大小在1、10 μm的淀粉比例逐漸增多，在1 μm處發(fā)酵24和48 h差別不明顯。這是由于淀粉的無定形區(qū)遭到水解，大顆粒淀粉變成小顆粒淀粉，粒徑減??；在發(fā)酵后期，顆粒淀粉水解粒徑主要集中在10 μm。這與李麗[19]在研究自然發(fā)酵對黃米淀粉的粒徑大小中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵對淀粉的粒徑并未產(chǎn)生影響的結(jié)果相反，這主要是由于它們的發(fā)酵體系不同，自然發(fā)酵和酵母菌發(fā)酵優(yōu)勢菌種不同，菌的產(chǎn)酶產(chǎn)酸能力也不同。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間糯米淀粉的粒徑分布Fig.5 Size distribution of waxy rice starch at different fermentation times

2.6 發(fā)酵對糯米淀粉表觀結(jié)構(gòu)的影響

未發(fā)酵與發(fā)酵不同時(shí)間的糯米淀粉的表觀結(jié)構(gòu)如圖6所示，未發(fā)酵糯米淀粉顆粒呈不規(guī)則的多面體結(jié)構(gòu)，菱角表面光滑。經(jīng)發(fā)酵過的淀粉與原淀粉有明顯的差別，其表面有明顯的的孔洞，并且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長淀粉顆粒表面的孔洞增多，LU等[20]在研究自然發(fā)酵對米粉的影響中有相似的結(jié)果，這主要是因?yàn)榘l(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸和酶等對淀粉的水解作用，淀粉顆粒內(nèi)部的直鏈淀粉被溶出[15]。

A-0 h；B-12 h；C-24 h；D-48 h圖6 不同發(fā)酵時(shí)間淀粉的顆粒形態(tài)Fig.6 Different fermentation time of waxy rice starch granules on the morphology

3 結(jié)論

通過對糯米粉發(fā)酵過程中的淀粉進(jìn)行提取，與未發(fā)酵的糯米淀粉作比較，探討酵母菌發(fā)酵對糯米粉中淀粉結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵能夠促進(jìn)支鏈淀粉中短鏈的分解；發(fā)酵并未形成新的官能團(tuán)，但使淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，發(fā)酵12 h前朝著有序的方向改變，發(fā)酵12 h后朝著無序的方向發(fā)展；它的晶型并未改變，但是結(jié)晶度發(fā)生了變化，其結(jié)晶度先升高后降低；粒徑分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵使淀粉顆粒粒徑逐漸減??；淀粉的球晶結(jié)構(gòu)變化不是特別顯著，但淀粉的表面遭到侵蝕產(chǎn)生諸多孔洞。本研究從不同角度研究糯米粉發(fā)酵對淀粉結(jié)構(gòu)的影響。綜合上述結(jié)果，酵母菌發(fā)酵使糯米淀粉的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，本文闡明了糯米粉發(fā)酵對淀粉的改性作用機(jī)理，有助于促進(jìn)糯米粉相關(guān)發(fā)酵產(chǎn)品的研發(fā)，提高糯米粉的應(yīng)用價(jià)值與經(jīng)濟(jì)效益。