黃子珂， 宋越強(qiáng)， 張 熙， 童偉芳， 李思光

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，上海 200092; 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200065)

腦出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是由于腦血管破裂導(dǎo)致血液溢出至腦實(shí)質(zhì)或蛛網(wǎng)膜下而造成的神經(jīng)損傷，我國(guó)腦出血發(fā)病率占腦卒中的17.1%～55.4%，遠(yuǎn)高于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家的6.5%～19.6%[1-3]；且腦出血易復(fù)發(fā)、預(yù)后差、死亡率高，患者即使存活，生活質(zhì)量也大大降低[4-5]。目前較有前景的治療手段為干細(xì)胞治療法，其中內(nèi)源性干細(xì)胞由于不存在細(xì)胞來(lái)源、排斥以及成瘤等問題[6]，因此具有很強(qiáng)的治療潛力。大腦中存在多種類型的干性細(xì)胞，如神經(jīng)干細(xì)胞和血管干細(xì)胞等。而當(dāng)大腦受到損傷后，周細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞等終末分化細(xì)胞在損傷因子的刺激下能發(fā)生重編程而獲得干性，共同參與修復(fù)。CD133(prominin-1)在神經(jīng)干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞及血管祖細(xì)胞等多種干/祖細(xì)胞中均有表達(dá)[7]，小鼠室管膜下區(qū)存在可被激活的CD133+神經(jīng)干細(xì)胞，激活后能進(jìn)一步分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞[8-9]。本研究將CD133-Cre-ERT2轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠以及含Rosa26-CAG-LSL-ZsGreen報(bào)告基因C57BL/6小鼠雜交，得到可示蹤C(jī)D133+干細(xì)胞的CD133-CreER；CAG-ZsGreen示蹤小鼠，利用該小鼠制備紋狀體出血性腦卒中動(dòng)物模型，探究CD133+干細(xì)胞遷移、增殖與分化情況，分析評(píng)價(jià)CD133+干細(xì)胞對(duì)出血性卒中損傷的修復(fù)作用；同時(shí)觀察損傷區(qū)域或附近的周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等終末分化細(xì)胞受損傷因子刺激而參與損傷修復(fù)情況，為臨床腦出血研究提供生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

他莫昔芬(tamoxifen，T5648)、三溴乙醇(T48402)、封片劑(O8015)、蔗糖(V900116)、玉米油(C8267)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；4%多聚甲醛(PFA，p1110)、Tween20(T8220)、Triton-X100(T8200)購(gòu)自北京索萊寶公司；驢血清(Y2-017-111-121-10)購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司；兔抗小鼠GFAP多克隆抗體(Anti-GFAP，A0237)購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司；小鼠抗GFAP單隆抗體(anti-GFAP，MAB3402)購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore公司；兔抗小鼠雙皮質(zhì)素多克隆抗體(anti-DCX，ab18723)、兔抗小鼠血小板源性生長(zhǎng)因子受體多克隆抗體(anti-PDGFRβ，ab32570)、小鼠抗Nestin單克隆抗體(anti-Nestin，ab6142)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；驢抗兔Alexa Fluor 555二抗(A-31572)、驢抗小鼠Alexa Fluor 647二抗(A-31571)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；無(wú)水乙醇(10009218)購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)有限公司。

多聚賴氨酸包被載玻片(188105w)、粘附蓋玻片(10212450c)購(gòu)自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司；立體定位注射儀(68025)購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司、冰凍切片機(jī)(CM1905)、石蠟切片機(jī)(RM2125)購(gòu)自德國(guó)萊卡公司、漢密爾頓微量50μL進(jìn)樣針(765501)購(gòu)自美國(guó)Hamilton公司；手術(shù)刀、眼科顯微剪、彎鑷、一次性1mL注射器、雙針尼龍縫合針購(gòu)自上海醫(yī)療器械股份有限公司；激光共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)(A1R)購(gòu)自日本尼康公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性CD133+細(xì)胞譜系示蹤小鼠(CD133-Cre-ERT2；CAG-loxP-STOP-loxP-ZsGreen)由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建。24只體質(zhì)量25～30g雄性小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組與出血組，每組12只，其中出血組再分為損傷后1、3、7、14d組，每組3只。

1.3 他莫昔芬的配制以及注射

將0.1g他莫昔芬溶加入55℃預(yù)熱的1mL無(wú)水乙醇中，并于55℃水浴至晶體充分溶解，然后用55℃預(yù)熱的吸頭將其轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的9mL玉米油中，反復(fù)吹打混勻，得到終質(zhì)量濃度為10mg/mL的他莫昔芬溶液，分裝并置于-20℃保存。

小鼠每日200μL連續(xù)注射他莫昔芬溶液5d，注射7d后進(jìn)行腦出血?jiǎng)游锬Ｐ椭苽洹?/p>

1.4 出血性腦損傷小鼠模型的構(gòu)建

25mg/mL三溴乙醇腹腔注射麻醉，剔除小鼠頭頂毛發(fā)并固定至立體定位注射儀上，75%乙醇消毒，由小鼠雙眼連線中點(diǎn)起向鼠尾方向切一長(zhǎng)約1cm切口，暴露小鼠前后囟，使用過氧化氫清洗前囟位置。參考小鼠腦圖譜，于前囟右2.0mm、后0.2mm處用鉆頭鉆一直徑1mm左右的顱孔。取小鼠尾靜脈自體血30μL并迅速轉(zhuǎn)移至漢密爾頓微量注射器，經(jīng)上述顱孔進(jìn)針，待針尖全部沒入小鼠顱孔，進(jìn)針深度3mm，以2μL/min速度注射小鼠自體血5μL，停針5min后再垂直進(jìn)針0.7mm，以同樣速度注射剩余25μL血液，停針5min后緩慢抽出針頭，用骨蠟填補(bǔ)顱孔并縫合創(chuàng)口。假手術(shù)組僅垂直進(jìn)針3.7mm插入紋狀體，不進(jìn)行血液注射，其余操作與出血組一致。小鼠術(shù)后置于37℃電熱毯保溫至清醒，轉(zhuǎn)移至干凈鼠籠25℃恒溫飼養(yǎng)，飼料用水浸泡后喂食，小鼠術(shù)后允許自由活動(dòng)。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)價(jià)

出血組及假手術(shù)組分別于損傷后1、3、7、14d進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分，參考國(guó)際公認(rèn)的小鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(modified neurological severity score, mNSS)進(jìn)行評(píng)分[10]。評(píng)價(jià)最高為14分，包括動(dòng)力測(cè)試、感官測(cè)試以及反射等方面，1～4分為輕度損傷，5～9分為中度損傷，10～14分為重度損傷。剔除損傷后第1天時(shí)輕度損傷小鼠，采用中重度損傷5～14分小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剔除小鼠隨機(jī)補(bǔ)充。

1.6 DCX、GFAP和PDGFRβ免疫熒光單標(biāo)記染色

出血組小鼠分別于損傷后1、3、7、14d處死，取腦組織4%多聚甲醛固定過夜并脫水，OCT包埋，并置于-80℃冷凍過夜保存。使用冰凍切片機(jī)10μm厚度冠狀連續(xù)切片，保留紋狀體部位切片；每隔6張切片取1張切片PBS洗滌，4%驢血清、0.3%Triton X-100封閉液室溫封閉1h，分別滴加兔抗小鼠DCX(1∶1000)多克隆抗體、兔抗小鼠GFAP(1∶200)多克隆抗體和兔抗小鼠PDGFRβ(1∶200)多克隆抗體一抗50μL后4℃過夜孵育。棄掉一抗并PBS洗滌后滴加對(duì)應(yīng)二抗與DAPI免疫染色劑室溫孵育1h，PBS洗5min重復(fù)3次，切片吸干水分后滴加Mount封閉液封片，4℃保存。

1.7 Ki67/GFAP和PDGFRβ/Nestin免疫熒光雙標(biāo)記染色

小鼠腦組織切片取出平衡室溫，吹干后用1×PBS清洗3次并滴加上述封閉液室溫封閉1h；每隔6張切片取1張，進(jìn)行以下組合一抗染色: 兔抗小鼠Ki67多克隆抗體(1∶500)和小鼠抗GFAP單克隆抗體(1∶500)、兔抗小鼠PDGFRβ多克隆抗體(1∶200)和小鼠抗Nestin單克隆抗體(1∶200)。4℃孵育過夜后，1×PBS洗滌3次并滴加對(duì)應(yīng)二抗與DAPI免疫染色劑室溫孵育1h，1×PBS洗3次后滴加Mount封片劑封片，4℃保存。

1.8 共聚焦顯微鏡觀察與細(xì)胞計(jì)數(shù)

采用激光共聚焦顯微鏡觀察上述切片，DAPI、ZsGreen、Alexa Fluor 555以及Alexa Fluor 647熒光信號(hào)分別在激發(fā)波長(zhǎng)405、488、561、640nm和發(fā)射波長(zhǎng)461、505、568、668nm下檢測(cè)并掃描。選取出血損傷后1、3、7、14d等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)共3只小鼠，每只小鼠取3張腦片，拍攝損傷灶周以及對(duì)側(cè)相應(yīng)位置的3個(gè)20倍鏡視野，分別計(jì)數(shù)PDGFRβ+和GFAP+細(xì)胞，以細(xì)胞完整處于視野中，且與DAPI信號(hào)共定位計(jì)算為1個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞，結(jié)合專業(yè)軟件Image J分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，由圖像標(biāo)尺得出視野面積并計(jì)算單只小鼠PDGFRβ+和GFAP+細(xì)胞密度平均值；由于室管膜下區(qū)(subventricular zone, SVZ)為神經(jīng)發(fā)生的主要區(qū)域，因此每只小鼠選取8張腦片拍攝出血側(cè)與對(duì)側(cè)SVZ區(qū)1個(gè)20倍鏡視野，并以相同方式計(jì)數(shù)DCX+細(xì)胞數(shù)量和單只小鼠DCX陽(yáng)性細(xì)胞密度平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能損傷評(píng)分

參照mNSS神經(jīng)功能損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分別于損傷后1、3、7、14d對(duì)出血組與假手術(shù)組進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分。所有腦出血組小鼠損傷后1d時(shí)神經(jīng)功能損傷評(píng)分均高于4分，無(wú)剔除小鼠。損傷后1、3、7、14d各個(gè)時(shí)間點(diǎn)出血組的神經(jīng)功能損傷明顯，而假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能損傷，出血組與假手術(shù)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且在出血組小鼠在損傷后1d時(shí)神經(jīng)功能缺損最嚴(yán)重，隨損傷后時(shí)間增多出血組的神經(jīng)功能缺損逐漸降低，至損傷后14d時(shí)損傷明顯改善，見圖1。

2.2 腦出血可誘導(dǎo)損傷灶周的PDGFRβ+周細(xì)胞獲得干性

周細(xì)胞的來(lái)源與間充質(zhì)干細(xì)胞相同，也是中胚層，因此具有與間充質(zhì)干細(xì)胞非常相似的干性特征。為探究血管周細(xì)胞在腦出血大腦中是否能獲得干性，本研究中采用免疫熒光標(biāo)記染色觀察出血灶周的血管周細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)出血損傷3d后出血灶周圍PDGFRβ+與Nestin+共定位，見圖2。

為進(jìn)一步探究腦出血損傷對(duì)周細(xì)胞數(shù)量的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)損傷后1、3、7、14d損傷側(cè)紋狀體區(qū)以及對(duì)側(cè)同等位置的周細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)損傷后1、3、7、14d兩側(cè)周細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且均不隨損傷后時(shí)間的變化而改變，提示出血損傷能誘導(dǎo)血管周細(xì)胞獲得干性，具有重編程為神經(jīng)細(xì)胞或血管細(xì)胞的潛能，但出血損傷對(duì)周細(xì)胞的數(shù)量并無(wú)影響，見圖3。

圖2 損傷附近的血管周細(xì)胞與Nestin共定位Fig.2 Co-expressing of PDGFRβ with neural stem/progenitor cell marker Nestin

圖3 損傷后兩側(cè)紋狀體周細(xì)胞數(shù)量對(duì)比Fig.3 Comparison the number of pericytes in hemorrhage side and non-surgery side at different time points after injury

2.3 腦出血損傷可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖

為研究星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦出血后的變化，本實(shí)驗(yàn)對(duì)損傷后1、3、7、14d損傷側(cè)紋狀體區(qū)以及對(duì)側(cè)同等區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了數(shù)量統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，損傷后1d起損傷側(cè)紋狀體區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞密度明顯多于對(duì)側(cè)同等位置，且數(shù)量會(huì)進(jìn)一步隨損傷后時(shí)間增加而遞增，至損傷后14d時(shí)密度達(dá)到最大，與對(duì)照側(cè)數(shù)量相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 損傷后不同時(shí)間點(diǎn)損傷側(cè)紋狀體區(qū)與對(duì)照側(cè) 同等位置星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量對(duì)比Fig.4 Comparison the number of astrocytes in hemorrhage side and non-surgery side at different time points after injury與對(duì)照側(cè)相比，**P<0.01，***P<0.001

2.4 腦出血誘導(dǎo)CD133+干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化

在損傷后3d觀察到損傷灶周出現(xiàn)大量新生細(xì)胞，其中有少量細(xì)胞為Ki67+/GFAP+/ZsGreen+三陽(yáng)性細(xì)胞，這一結(jié)果提示腦出血能激活CD133+干細(xì)胞，產(chǎn)生新生的星形膠質(zhì)細(xì)胞，見圖5。

圖5 損傷側(cè)出現(xiàn)少量Ki67+、GFAP+、ZsGreen+細(xì)胞Fig.5 Ki67+,GFAP+，ZsGreen+ labeled cells in intracerebral hemorrhage side

2.5 腦出血誘導(dǎo)CD133+細(xì)胞向神經(jīng)祖細(xì)胞分化

為研究CD133+細(xì)胞在腦出血損傷后是否能向神經(jīng)元方向分化，本實(shí)驗(yàn)使用成神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志DCX進(jìn)行免疫熒光染色并觀察在損傷后ZsGreen標(biāo)記的CD133+細(xì)胞是否與DCX共定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腦出血損傷后1d兩側(cè)SVZ區(qū)出現(xiàn)少量DCX+細(xì)胞細(xì)胞且在兩側(cè)的數(shù)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖6；到損傷后7d損傷側(cè)SVZ區(qū)出現(xiàn)大量DCX+成神經(jīng)細(xì)胞，數(shù)量明顯多于對(duì)照側(cè)同等位置，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且DCX+成神經(jīng)細(xì)胞沿胼胝體向損傷部位遷移；部分DCX+成神經(jīng)細(xì)胞來(lái)源于ZsGreen標(biāo)記細(xì)胞且已遷移至離室管膜較遠(yuǎn)區(qū)域，見圖7，兩側(cè)來(lái)自ZsGreen的DCX+成神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；到損傷后14d，損傷側(cè)DCX+細(xì)胞與DCX+/ZsGreen+細(xì)胞數(shù)量快速減少，但數(shù)量仍有高于對(duì)照側(cè)細(xì)胞數(shù)量趨勢(shì)。以上結(jié)果證明腦出血能誘導(dǎo)CD133+干性細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化以及增強(qiáng)SVZ的神經(jīng)發(fā)生以及遷移，在出血后7d時(shí)達(dá)到峰值，隨后降低。

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)腦損傷兩側(cè)室管膜下區(qū)產(chǎn)生 DCX+成神經(jīng)細(xì)胞對(duì)比Fig.6 Comparison the DCX+ neural progenitor cells in two sidesA: 兩側(cè)DCX+細(xì)胞密度對(duì)比；B: 兩側(cè)DCX+細(xì)胞密度變化對(duì)比；C: 兩側(cè)DCX+/ZsGreen+細(xì)胞密度變化對(duì)比；與對(duì)照側(cè)相比，*P<0.05，**P<0.01

圖7 出血損傷誘導(dǎo)ZsGreen標(biāo)記的CD133+ 細(xì)胞分化為DCX+細(xì)胞并遷移Fig.7 Hemorrhagic injury induces differentiation and migration of ZsGreen-labeled CD133+cellsA: 來(lái)自ZsGreen標(biāo)記細(xì)胞的DCX+成神經(jīng)細(xì)胞沿胼胝體遷移至較遠(yuǎn)離SVZ的區(qū)域；B～D: A圖中b白框區(qū)域放大圖像

3 討 論

腦出血是一種致死率、致殘率極高的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[11]，目前已有的治療方法仍然無(wú)法有效降低死亡率。內(nèi)源性或外源性干細(xì)胞治療腦出血具有極大的潛能，然而外源性的干細(xì)胞治療則存在時(shí)間窗、成瘤等問題[6]，因此如果能激活內(nèi)源性干細(xì)胞的增殖分化以及使終末分化的細(xì)胞獲得干性并重編程，對(duì)治療腦損傷將具有重大的意義。周細(xì)胞是重要的神經(jīng)血管單元成員細(xì)胞，腦微血管外包裹周細(xì)胞的比例是所有器官中最高的[12]，且越來(lái)越多的研究證明周細(xì)胞能轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞并進(jìn)一步分化為神經(jīng)祖系或血管祖系的細(xì)胞[13-15]。周細(xì)胞在大腦中覆蓋大部分微血管，且周細(xì)胞表達(dá)多種間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物，與間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有多能分化的潛能，周細(xì)胞隨腦微血管分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各個(gè)角落，已有證據(jù)表明當(dāng)損傷發(fā)生后血管周細(xì)胞能迅速感知信號(hào)并脫離血管參與修復(fù)[16]。在本研究發(fā)現(xiàn)腦出血損傷誘導(dǎo)血管周細(xì)胞去分化并重新獲得干性，表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin，證明周細(xì)胞在腦出血損傷中具有分化的潛能。周細(xì)胞在大腦中數(shù)目眾多且分布廣泛，周細(xì)胞若能進(jìn)一步重編程為神經(jīng)細(xì)胞或血管細(xì)胞應(yīng)具有非常重要的意義。

星形膠質(zhì)細(xì)胞占大腦神經(jīng)細(xì)胞的大多數(shù)，它們通過伸出足板與腦血管壁接觸并包裹于管壁外，同時(shí)與神經(jīng)元突觸建立聯(lián)系，這使得星形膠質(zhì)細(xì)胞能耦合神經(jīng)元的功能與血流的變化[17]，因此星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元和血管系統(tǒng)具有非常緊密的聯(lián)系。正常生理狀況下的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有形成血腦屏障、支持血管結(jié)構(gòu)以及維持內(nèi)環(huán)境等諸多功能，腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞則具有神經(jīng)保護(hù)等功能[18]。缺血與出血損傷均能引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能缺失以及增殖[19]，在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)在損傷側(cè)紋狀體存在大量的星形膠質(zhì)細(xì)胞，它們的數(shù)量與未被損傷一側(cè)相比具有明顯優(yōu)勢(shì)(P<0.01)，且損傷側(cè)紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量隨損傷后時(shí)間增加而進(jìn)一步增多。新生的星形膠質(zhì)細(xì)胞可能替代受到損傷而造成功能缺失的星形膠質(zhì)細(xì)胞，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并逐步改善損傷周圍內(nèi)環(huán)境。星形膠質(zhì)細(xì)胞具有復(fù)雜的功能，雖然它們會(huì)形成膠質(zhì)瘢痕阻礙神經(jīng)再生，但近年來(lái)的證據(jù)已逐漸證明星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)是有利的[20-21]。

神經(jīng)干細(xì)胞是指具有自我更新以及多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞，在不同的時(shí)間或條件下可分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。CD133最初被發(fā)現(xiàn)于臍帶及外周血干細(xì)胞中[22-23]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)CD133在神經(jīng)干細(xì)胞中也有表達(dá)，且已有許多證據(jù)證明室管膜存在CD133+靜息態(tài)神經(jīng)干細(xì)胞且能夠在損傷或特定條件下被激活并增殖分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞[8-9，24]。本研究利用遺傳學(xué)Cre-Loxp系統(tǒng)構(gòu)建了可示蹤C(jī)D133+細(xì)胞分化譜系的轉(zhuǎn)基因小鼠并制備出血性腦卒中動(dòng)物模型，在本研究中首次發(fā)現(xiàn)在出血損傷后CD133+細(xì)胞能分化為DCX+成神經(jīng)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞，這代表CD133+細(xì)胞在出血腦內(nèi)具有向神經(jīng)祖系細(xì)胞分化的能力。值得注意的是，在損傷后7d時(shí)的修復(fù)高峰期也僅10.35%±3.01%的DCX+成神經(jīng)細(xì)胞來(lái)自CD133+細(xì)胞，更多的成神經(jīng)細(xì)胞可能由其他干性細(xì)胞分化增殖而來(lái)，在未進(jìn)行任何干預(yù)的情況下，CD133+細(xì)胞自發(fā)對(duì)損傷的修復(fù)所占比例并不大，而CD133+細(xì)胞修復(fù)腦損傷的機(jī)制還需進(jìn)一步的研究；同時(shí)DCX+細(xì)胞以及來(lái)自CD133+細(xì)胞的ZsGreen+/DCX+細(xì)胞數(shù)量在損傷后7d達(dá)到峰值，隨后損傷后14d兩側(cè)DCX+與DCX+/ZsGreen+細(xì)胞均降低，根據(jù)Gong等[25]的研究結(jié)果，腦出血損傷造成的炎性環(huán)境對(duì)神經(jīng)細(xì)胞會(huì)造成進(jìn)一步損傷，炎性環(huán)境可能是造成DCX+細(xì)胞數(shù)量大量減少的重要原因。

總而言之，進(jìn)一步探究?jī)?nèi)源性干細(xì)胞對(duì)腦損傷的修復(fù)機(jī)制，促使神經(jīng)干細(xì)胞釋放其潛能，充分動(dòng)員神經(jīng)血管單元成員參與損傷應(yīng)答與修復(fù)，并改善損傷灶微環(huán)境，將有望成為一種快捷有效的出血性腦卒中治療手段。