摘要：豬流行性腹瀉是一種由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒引起的腸道病毒傳染病，病豬主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉和脫水，仔豬患病導(dǎo)致生長發(fā)育受阻，并且有很高的死亡率，加強豬流行性腹瀉病毒的診斷對疾病防控的作用至關(guān)重要，該文主要介紹豬流行性腹瀉診斷方法的最新研究進展，為豬流行性腹瀉病毒的綜合防控提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉;診斷方法;研究進展

中圖分類號：S858.28 文獻標(biāo)識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.20.052

0 引言

豬流行性腹瀉病毒是冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，是單股、正鏈的RNA病毒，豬流行性腹瀉病毒只有1種血清型，對外界環(huán)境和消毒藥抵抗力不強。豬流行性腹瀉病毒主要通過接觸感染，病毒主要在小腸和結(jié)腸絨毛上皮細胞漿中進行復(fù)制。豬流行性腹瀉病毒在寒冷季節(jié)高發(fā)，不同日齡的豬均易感，仔豬感染后死亡率更高，成年豬死亡率較低，主要是引起嘔吐和厭食。病豬是主要傳染源，病毒可污染飼料、飲水造成病毒在豬舍快速傳播，豬流行性腹瀉病毒的主要診斷方法包括以下幾種。

1 RT-PCR方法

RT-PCR方法是疾病檢測最常用的方法，通過設(shè)計豬流行性腹瀉病毒的特異性檢測引物，提取病毒的核酸基因組，在合適的擴增反應(yīng)條件下對病毒基因組片段進行特異性擴增，通過觀察擴增片段的大小進行疾病診斷。韓昊瑩[1]等根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬流行性腹瀉病毒疫苗株ORF3基因序列，在245～293位缺失區(qū)域兩側(cè)設(shè)計并合成1對特異性引物，建立了快速鑒別檢測豬流行性腹瀉病毒野毒株和疫苗株的RT-PCR方法，該方法敏感性高，對豬流行性腹瀉病毒野毒株、疫苗株可分別擴增出長度為282 bp和233 bp的特異性片段最低檢測下限分別為455 coies/μL和396 coies/μL，該方法特異性好，對豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬細小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬博卡病毒、豬偽狂犬病毒核酸擴增均為陰性，該方法不僅可用于豬流行性腹瀉病毒的檢測，還可區(qū)別豬流行性腹瀉病毒野毒株和疫苗株，為豬流行性腹瀉病毒防控提供有效地技術(shù)保障。

2 巢式RT-PCR方法

巢式RT-PCR方法是在普通RT-PCR方法的基礎(chǔ)上增加一輪PCR擴增，通常設(shè)計2套檢測引物，在第1輪擴增結(jié)束后利用第1次擴增的引物進行第2輪PCR擴增，該檢測方法敏感性更高，特異性更強。鄧祖麗穎[2]等根據(jù)GenBank中豬流行性腹瀉病毒基因組序列，在M基因的內(nèi)、外設(shè)計2對特異性檢測引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立豬流行性腹瀉病毒的巢式RT-PCR檢測方法，該巢式RT-PCR檢測方法最低可檢測50fg豬流行性腹瀉病毒RNA模板，與豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及豬瘟病毒沒有交叉反應(yīng)。巢式RT-PCR檢測方法特異性強，敏感性高，適用于微量豬流行性腹瀉病毒核酸的檢測。

3 多重RT-PCR方法

多重RT-PCR方法是設(shè)計多個疾病檢測引物，在一次PCR反應(yīng)中加入所有引物，實現(xiàn)對多種病原體的檢測。王睿敏[3]等分別參照豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬Delta冠狀病毒和豬輪狀病毒的基因序列設(shè)計特異性檢測引物，預(yù)期擴增片段大小分別為750、544、183和329bp，通過對引物濃度、退火溫度等反應(yīng)條件的優(yōu)化，成功建立豬流行性腹瀉病毒豬傳染性胃腸炎病毒豬Delta冠狀病毒和豬輪狀病毒的多重RT-PCR檢測方法，該檢測方法對豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬Delta冠狀病毒和豬輪狀病毒的檢測結(jié)果為陽性，四種病毒重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出下限分別為1.57×10、1.57×10、1.57×10、1.57×10coies/L，對口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬細小病毒等的擴增均為陰性。多重RT-PCR檢測方法可以用于豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬Delta冠狀病毒和豬輪狀病毒的快速鑒別檢測及流行病學(xué)調(diào)查。

4 熒光定量RT-PCR方法

熒光定量RT-PCR檢測方法是在RT-PCR方法的基礎(chǔ)上引入熒光標(biāo)記技術(shù)，通過實時監(jiān)測熒光強度實現(xiàn)對病毒核酸擴增的定量檢測，該檢測方法的敏感性更好。王以欣[4]等豬流行性腹瀉病毒的N基因為靶基因，基于雙啟動寡核苷酸引物（DPO），經(jīng)過條件優(yōu)化，建立了基于DPO引物檢測豬流行性腹瀉病毒熒光定量RT-PCR方法，該檢測方法DPO引物的有效退火溫度是45～65℃，PEDV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測限可達1.64×10coies/μL，敏感性高，與常規(guī)RT-PCR方法檢測結(jié)果的陽性符合率為92.31%，為豬流行性腹瀉病毒的準(zhǔn)確檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。

5 RT-LAMP方法

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增RT-LAMP檢測方法是一種等溫核酸擴增技術(shù)，該檢測方法的優(yōu)點是操作方便，不需要特殊儀器設(shè)備，常溫水浴鍋可以進行擴增，非常適合臨床現(xiàn)地應(yīng)用。邵建宏[5]等建立熒光RT-LAMP法檢測豬流行性腹瀉病毒，該方法根據(jù)豬流行性腹瀉病毒核蛋白基因序列設(shè)計一套特異性LAMP引物，該檢測方法特異性強、靈敏度高、檢測速度快，可廣泛應(yīng)用于豬流行性腹瀉的快速篩查及實驗室檢測，為豬流行性腹瀉的早期診斷和治療提供技術(shù)支持。

6 結(jié)束語

豬流行性腹瀉病毒對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，該病傳播迅速，豬群普遍易感，一旦發(fā)病、難以阻斷，疾病的快速準(zhǔn)確的早期診斷對其綜合防控起到關(guān)鍵作用，只有綜合運用各種檢測方法，積極開展豬流行性腹瀉病毒的診斷和流行病學(xué)調(diào)查，為豬流行性腹瀉病毒的臨床診治提供合理的科學(xué)依據(jù)。臨床可根據(jù)需要采用不同的檢測方法，如單純豬流行性腹瀉病毒感染可采用普通的RT-PCR檢測方法，對檢測結(jié)果的靈敏度要求較高的可采用熒光定量PCR檢測方法和巢式PCR檢測方法，幾種疾病混合感染的可采用多重PCR檢測方法，臨床現(xiàn)地應(yīng)用時可以采用LAMP檢測方法，可根據(jù)自身試驗條件及檢測的目的和要求運用合適的檢測方法或者綜合運用多種檢測方法，為豬流行性腹瀉病毒的綜合防控提供技術(shù)支持。

參考文獻

[1]韓昊瑩，鄭慧華，趙宇，等.鑒別豬流行性腹瀉病毒野毒株和疫苗株RT-PCR方法的建立[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2018，41（2）：84-88.

[2]鄧祖麗穎，陳陸.豬流行性腹瀉病毒巢式RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（1）：34-37.

[3]王睿敏，施開創(chuàng)，黎宗強，等.豬流行性腹瀉病毒豬傳染性胃腸炎病毒豬Delta冠狀病毒和豬輪狀病毒多重RT-PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2019，49（2）：190-198.

[4]王以欣，王紫薇，漢武嬌，等.基于DPO引物檢測豬流行性腹瀉病毒熒光定量RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2019，41（7）：710-715.

[5]邵建宏，曾俊霞，趙福振，等.熒光RT-LAMP法檢測豬流行性腹瀉病毒方法的建立[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2019，44（2）：42-45，52.

作者簡介：孫梅（1977-），女，山東平邑人，獸醫(yī)師，研究方向：臨床獸醫(yī)。