王寶娟 鄭曙光 周玉平 劉楊

〔摘要〕 目的 探討不同濃度碘乙酸鈉對家兔早期膝骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis， OA）模型的誘導(dǎo)及病理改變，確定建立OA模型的最小有效藥物濃度。方法 將36只新西蘭大白兔隨機分為正常（A）組、模型（B～F）組，共6組，每組6只。A組左膝關(guān)節(jié)腔注射0.2 mL無菌生理鹽水;B～E組左膝關(guān)節(jié)腔按照2.5、5、7.5、10 mg/kg劑量各注射0.2 mL的碘乙酸鈉溶液，F(xiàn)組注射劑量與E組相同，同時以30 min/d分2次驅(qū)趕運動為干預(yù)因素。建模14 d后，采用HE染色及骨性關(guān)節(jié)炎組織病理學(xué)評分（Mankin評分）觀察各組軟骨的病理改變。結(jié)果 Mankin評分與A組相比，B、C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），D、E、F組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與E組比較，F(xiàn)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 模型D組藥物濃度7.5 mg/kg為建立OA模型的最小有效藥物劑量，且模型建立方法操作簡單、創(chuàng)傷小，能夠保證膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性及實驗動物的成活率。

〔關(guān)鍵詞〕 骨性關(guān)節(jié)炎;膝關(guān)節(jié);軟骨細(xì)胞;動物模型

〔中圖分類號〕R965.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.03.007

Induction of Early Knee Osteoarthritis Model in Rabbits with Different

Concentrations of Sodium Iodoacetate and Its Pathological Changes

WANG Baojuan1， ZHENG Shuguang1*， ZHOU Yuping2， LIU Yang1

（1. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine， Guiyang， Guizhou 550025， China; 2. North China

University of Science and Technology， Tangshan， Hebei 063000， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the induction of early knee osteoarthritis （OA） model in rabbits with different concentrations of sodium iodoacetate and its pathological changes， and to identify the minimum effective drug concentration for establishing an OA model. Methods Thirty-six New Zealand white rabbits were randomly divided into one normal group （group A） and five model groups （groups B-F）， with 6 rabbits in each group. Group A was injected with 0.2 ml sterile saline into the left knee joint cavity. Groups B-E were injected with 0.2 ml sodium iodoacetate solution into the left knee joint cavity at doses of 2.5， 5， 7.5， and 10 mg/kg， respectively. Group F did driving movement （30 min/d， twice daily） as the intervention factor in addition to the treatment for group E. The pathological changes of cartilage in each group were evaluated by HE staining and the histopathological score of OA （Mankin score）. Results There were no significant differences in Mankin score between group A and groups B and C （P>0.05）， but there were significant differences in Mankin score between group A and groups D， E， and F （P<0.05）. There was no significant difference in Mankin score between group F and group E （P>0.05）. Conclusion The drug concentration （10 mg/kg） in group D was the minimum effective dose for establishing OA model. The method of establishing OA model is simple and minimally invasive， which can ensure the stability of knee joint and the survival rate of experimental animals.

〔Keywords〕 osteoarthritis; knee joint; chondrocyte; animal model

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis， OA）為一種退行性病變，系由于年齡的增長、肥胖、勞損、創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)先天性異常、關(guān)節(jié)畸形等諸多因素引起的關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生，又名骨關(guān)節(jié)病、退行性關(guān)節(jié)炎、老年性關(guān)節(jié)炎肥大性關(guān)節(jié)炎等，臨床表現(xiàn)為緩慢發(fā)展的關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、僵硬、關(guān)節(jié)腫脹、活動受限和關(guān)節(jié)畸形等[1]。近年來骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐漸上升，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生活水平。近年來研究人員在致力于治療骨性關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)上，建立OA模型的方法并展開相應(yīng)的研究，實驗多使用嚙齒目動物[2]（大鼠、小鼠、豚鼠）、馬、羊、犬、豬、新西蘭大白兔等，因兔性情溫順，體型適中，行走時下肢負(fù)重，接近于人類的下肢負(fù)重情況，所以是最常用的動物模型?，F(xiàn)階段建立OA的動物模型的方法也是多種多樣，例如機械制動法、關(guān)節(jié)腔注射藥物、手術(shù)方法等[3]，本實驗摸索不同劑量碘乙酸鈉行家兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射誘導(dǎo)建立OA模型的可行性，為OA模型建立提供更簡便和成功率高的方法。

1 材料與方法

1.1? 動物及分組

健康成年新西蘭大白兔36只，雌雄各半，體質(zhì)量（2.0±0.3）kg，復(fù)合飼料喂養(yǎng)。實驗動物由貴陽中醫(yī)學(xué)院動物所提供，許可證號：SYXK（渝）2017-0006。將36只新西蘭大白兔隨機分為6組，每組6只：正常（A）組，模型（B～E）組（分別按照2.5、5、7.5、10 mg/kg給予不同濃度的碘乙酸鈉0.2 mL）、模型（F）組（碘乙酸鈉10 mg/kg+運動）。

1.2? 試劑

碘乙酸鈉（艾科生物試劑有限公司，產(chǎn)品批號：115058），HE染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司;產(chǎn)品批號：G1120），EDTA脫鈣液（北京索萊寶生物科技有限公司，產(chǎn)品批號：E1171）。

1.3? 儀器

RM2245石蠟切片機（德國萊卡），KD-BM包埋機（浙江金華科迪有限公司），XSZ-HS3顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠），常規(guī)手術(shù)器械、1 mL注射器。

1.4? 造模方法

用生理鹽水溶解碘乙酸鈉，配制成實驗所需不同濃度的碘乙酸鈉溶液。將家兔在無菌條件下，20%烏拉坦（4 mL/kg）麻醉，仰臥位固定于解剖臺上，微屈家兔左膝關(guān)節(jié)，剪掉關(guān)節(jié)周圍絨毛，消毒，以1 mL注射器由髕骨內(nèi)側(cè)下方斜上刺入關(guān)節(jié)腔，進(jìn)針后出現(xiàn)落空感為成功刺入關(guān)節(jié)腔。A組左膝關(guān)節(jié)腔注射0.2 mL無菌生理鹽水;B-E組左膝關(guān)節(jié)腔按照2.5、5、7.5、10 mg/kg劑量各注射0.2 mL的碘乙酸鈉溶液，F(xiàn)組注射劑量與E組相同，同時以30 min/d分2次驅(qū)趕運動為干預(yù)因素，連續(xù)驅(qū)趕干預(yù)14 d。建模14 d后兔耳緣靜脈注射空氣致栓塞方法處死。

1.5? 主要觀察指標(biāo)

1.5.1? 外觀形態(tài)? 兔處死后在左膝關(guān)節(jié)前正中切開皮膚，肉眼觀察不同組關(guān)節(jié)滑膜形態(tài)及厚度、關(guān)節(jié)腔積液;觀察關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)。

1.5.2? HE染色觀察軟骨病理改變? 用骨刀將膝關(guān)節(jié)離斷，浸入10%甲醛溶液固定，脫鈣48 h直至骨質(zhì)變軟，取軟骨及軟骨下骨，修剪成0.5 cm×0.8 cm大小，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋切片，分別用蘇木素-伊紅染色。常規(guī)脫蠟至水、蒸餾水沖洗5 min×3次、蘇木素染色10 min、自來水沖洗5 min×2次、95%的乙醇5 s、伊紅染色1 min、70%乙醇4 min、95%乙醇5 min、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5 min、滴加中性樹膠封片。每張切片選擇3個不同視野，并參照Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評分標(biāo)準(zhǔn)[4-5]進(jìn)行積分統(tǒng)計，見表1。

1.6? 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以“x±s”表示，組間比較用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 外觀觀察

A組膝關(guān)節(jié)無紅腫，屈伸功能正常;B、C組膝關(guān)節(jié)無明顯紅腫及屈伸功能障礙;D、E、F組可見左側(cè)膝關(guān)節(jié)明顯紅腫現(xiàn)象及屈伸障礙，但E、F組程度更重。

2.2? 滑膜形態(tài)觀察

A組滑膜無增厚現(xiàn)象，滑膜光澤明亮，少量淡黃色關(guān)節(jié)液，見圖1A;B、C組關(guān)節(jié)液無明顯增多，滑膜無明顯充血增生，見圖1B及圖1C;D組滑膜輕度充血增生，關(guān)節(jié)液少許增多，見圖1D;E、F組可見關(guān)節(jié)液明顯減少，滑膜增生明顯，見圖1E及圖1F。

2.3? 關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)觀察

A組關(guān)節(jié)軟骨呈半透明淺白藍(lán)色，表面光滑平整，無變形，無裂紋，無摩擦感，關(guān)節(jié)邊緣整齊，見圖2A;B、C組關(guān)節(jié)軟骨表面無明顯變化，關(guān)節(jié)邊緣依舊完整，見圖2B及圖2C;D組關(guān)節(jié)軟骨呈淡黃色，表面輕度凹凸不平，稍有粗糙感，見圖2D;E組可見關(guān)節(jié)軟骨呈灰黃色，失去原有光澤，表面粗糙，血管翳形成，見圖2E;F組可見關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，破壞嚴(yán)重，損傷較重，見圖2F。

2.4? 關(guān)節(jié)軟骨光鏡下觀察

A組HE染色顯示關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)面光滑完整，細(xì)胞分布均勻，層次清楚，基質(zhì)染色正常且均勻，潮線完整;見圖3A;B、C組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)未見明顯改變，細(xì)胞核仍為圓形或橢圓形，見圖3B及圖3C;D組可見軟骨表層不完整，骨組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見簇集的軟骨細(xì)胞，基質(zhì)染色輕染，細(xì)胞數(shù)量增多，以中性粒細(xì)胞為主，可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，見圖3D;E組可見軟骨損傷程度嚴(yán)重，軟骨層及軟骨下組織出現(xiàn)明顯的變性和崩解壞死，細(xì)胞數(shù)量增多且簇集分布嚴(yán)重，且較多為炎癥細(xì)胞浸潤，潮線完全消失，可見明顯的溶骨現(xiàn)象，見圖3E;F組可見細(xì)胞數(shù)量增加且多為炎性細(xì)胞，潮線完全消失，基質(zhì)失染明顯，見圖3F。

2.5? 組織學(xué)Mankin評分

Mankin評分：與A組比較，B、C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與A組比較，D、E、F組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與E組比較，F(xiàn)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

目前，OA的造模方法有如下三種：關(guān)節(jié)固定法[6]，關(guān)節(jié)腔內(nèi)手術(shù)法[7-8]，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物的方法[9]。雖然對于不同方法誘導(dǎo)膝骨性關(guān)節(jié)炎的報道很多，而關(guān)節(jié)腔內(nèi)手術(shù)法建立OA模型的方法較為常用[10]，這種方法是通過造成關(guān)節(jié)不穩(wěn)定的方式誘發(fā)OA，但也存在明顯的劣勢[11]，例如：造模時間過長、創(chuàng)傷較大、對動物生理結(jié)構(gòu)改變較多、難以模仿慢性疾病骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程等。關(guān)節(jié)腔注射藥物的方法因其建模所需時間較短，對實驗動物的損傷較少，可以保證實驗動物的成活率，逐漸被OA研究人員所接受。有研究報道[12]，因勞損是OA發(fā)病的病理因素之一，可將運動因素作為建立早期OA模型的主要干預(yù)因素之一，故本實驗設(shè)立注射劑量相同的E、F組，同時F組以30 min/d分2次驅(qū)趕運動為干預(yù)因素，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與E組比較，F(xiàn)組軟骨組織的病理切片Mankin評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），故由此發(fā)現(xiàn)，在建立早期OA模型的過程中，運動不能夠作為建立OA早期模型的主要干預(yù)因素。

目前國內(nèi)外關(guān)于OA模型建立的實驗研究中，采用關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉溶液造模的文獻(xiàn)較少，且目前較少有探討碘乙酸鈉溶液造成OA 的最小有效藥物濃度的實驗研究。本實驗采用關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉溶液的方式建立OA模型，從造模開始到成模共用2周時間，建模過程中無實驗動物死亡情況，造模后第3天觀察到D、E、F組左膝關(guān)節(jié)已經(jīng)出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象，通過病理切片能夠明顯觀察到各模型組膝關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)不同程度的損傷，并確定膝關(guān)節(jié)腔注射7.5 mg/kg的碘乙酸鈉，已能夠建立早期OA模型。關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉的方法，簡便易行、創(chuàng)傷小、動物成活率較高、實驗周期短，建立早期OA模型采用此種方法更加適用，值得進(jìn)一步研究應(yīng)用。

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