周淑芬 劉華清

摘?要：為進(jìn)一步研究水稻OsTZF3基因的生物學(xué)功能，利用日本晴基因組的OsTZF3基因序列，構(gòu)建了OsTZF3的CRISP/Cas9敲除表達(dá)載體pKTZF3和過(guò)量表達(dá)載體pCXUNTZF3;并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入粳稻日本晴胚性愈傷組織中，分別獲得了pKTZF3和pCXUNTZF3轉(zhuǎn)化再生植株55個(gè)和42個(gè)克隆;進(jìn)一步通過(guò)PCR法鑒定了35個(gè)克隆轉(zhuǎn)pKTZF3植株和10個(gè)克隆轉(zhuǎn)pCXUNTZF3植株。

關(guān)鍵詞：水稻;基因敲除;過(guò)量表達(dá);遺傳轉(zhuǎn)化;OsTZF3

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.03.001

Abstract：In order to further study the biological function of OsTZF3 gene in rice， the CRISP/Cas9 knockout expression vector pKTZF3 and overexpression vector pCXUNTZF3 of OsTZF3 were constructed by using the sequence of OsTZF3 gene in Nipponbare. 55 transformants of pKTZF3 and 42 clones of pCXUNTZF3 were obtained through Agrobacteriummediated transformation. Among them， 35 clones of pKTZF3 and 10 clones of pCXUNTZF3 were further identified by PCR detection.

Key words：Rice; Gene knockout; Overexpression; Transformation; OsTZF3

CCCH蛋白是一類特殊的鋅指蛋白，具有DNA和RNA結(jié)合的特性，在植物不同組織、發(fā)育階段及環(huán)境脅迫中具有多種功能。串聯(lián)鋅指（tandem zinc finger， TZF）基因是CCCH型鋅指蛋白基因的一個(gè)亞家族，其編碼蛋白包含一個(gè)保守的TZF模體，參與了多種細(xì)胞過(guò)程。進(jìn)化上最保守的TZF模體是由中間隔18個(gè)氨基酸的2個(gè)相同CX8CX5CX3H結(jié)構(gòu)域組成[1-2]。在植物還含有一類特殊的TZF模體，其結(jié)構(gòu)特征為CX7-8CX5CX3HX16CX5CX4CX3H，即由中間間隔16個(gè)氨基酸的2個(gè)不同CX8CX5CX3H結(jié)構(gòu)域組成，且其上游50個(gè)氨基酸處存在1個(gè)富含精氨酸區(qū)，因此這類基因又稱為RRTZF型鋅指蛋白基因[3]。植物特有TZF基因受多種發(fā)育階段和環(huán)境信號(hào)的影響，在植物中的表達(dá)模式呈多樣化[4]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及越來(lái)越多生物基因組測(cè)序的完成，反向遺傳學(xué)技術(shù)已成為基因功能分析的重要手段。在植物中，常用的反向遺傳學(xué)研究手段包括基因過(guò)表達(dá)、基因敲除/基因打靶、基因沉默（反義RNA和RNAi等）和基因激活等。對(duì)功能冗余基因的分析常用基因過(guò)量表達(dá)方法，基因敲除或基因沉默技術(shù)則是基因功能研究的主要方法。CRISPR/Cas9技術(shù)[5]是近年新興的一項(xiàng)基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，由與特異DNA序列反向互補(bǔ)的sgRNA和核酸內(nèi)切酶Cas9組成，前者負(fù)責(zé)識(shí)別特異基因靶點(diǎn)，后者實(shí)現(xiàn)DNA的切割。該系統(tǒng)無(wú)基因序列、細(xì)胞類型和物種的限制，簡(jiǎn)單高效、費(fèi)用便宜，受到廣大研究者的青睞[6]。水稻OsTZF3是一個(gè)RRTZF型鋅指蛋白基因，其他功能尚未被研究。本研究構(gòu)建了水稻OsTZF3基因的CRISPR/Cas9敲除和過(guò)量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化水稻，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?植物材料

轉(zhuǎn)基因受體材料為粳稻（Oryza sativa L.ssp.Japonica）日本晴（Nipponbare）。

1.2?載體與菌株

大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌LBA4404和植物過(guò)表達(dá)載體pCXUN，均由福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3?主要試劑

CRISPR/Cas9試劑盒（北京唯尚立德公司），primerstar高保真酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit（TaKaRa公司），Taq DNA 聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒（天根生化科技有限公司），引物合成、DNA測(cè)序（上海博尚生物技術(shù)有限公司），潮霉素（Roche 公司），組織培養(yǎng)試劑（Sigma公司）。

1.4?CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

載體構(gòu)建采用北京唯尚立德公司提供的植物 Cas9/gRNA 質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒（Catalog.No.VK00501），具體步驟如下：1）將合成的gRNA靶點(diǎn)引物對(duì)溶解并稀釋成10 μmol·L-1，各取

5 μL加15 μL H2O混合成25 μL最終體系，并按如下程序合成引物二聚體：95℃變性3 min，自然冷卻或在PCR儀中以3℃·min-1的速率降至25℃，16℃ 5 min。2）取Cas9/gRNAVector 1 μL、引物二聚體1 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、10× T4 DNA Ligase Buffer 1 μL、H2O 6 μL，混合成10 μL反應(yīng)體系，16℃水浴2 h，獲得引物二聚體與載體的連接產(chǎn)物。3）取連接最終產(chǎn)物5～10 μL，熱激法轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，次日挑取3～5個(gè)白色單菌落搖菌培養(yǎng)并測(cè)序，測(cè)序引物序列5′AGCCATGAATAGGTCTATGAC 3′。獲得正確的引物二聚體與VK00501連接的最終敲除表達(dá)載體，并電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA 4404，于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5?過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

以日本晴基因組DNA為模板，用TZF3F和TZF3R引物（表1）及高保真酶（PrimeSTAR）PCR擴(kuò)增獲得OsTZF3基因全長(zhǎng)。用Xcm I酶切pCXUN質(zhì)粒，獲得3′末端突出一個(gè)T堿基的線性骨架載體，與OsTZF3基因的PCR產(chǎn)物連接，經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證后獲得正確的OsTZF3植物過(guò)表達(dá)載體并電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA 4404，于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6?水稻遺傳轉(zhuǎn)化

以日本晴的幼胚誘導(dǎo)愈傷組織，并用于隨后的轉(zhuǎn)化。水稻愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代及與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)，抗性愈傷組織的篩選及再生等相關(guān)的培養(yǎng)基和具體的試驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

1.7?轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)

以CTAB法[8]提取葉片基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增篩選轉(zhuǎn)基因植株，PCR引物如表1所示。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，56～60℃退火45 s（溫度依據(jù)GC含量高低而定），72℃延伸45 s至3 min（時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增長(zhǎng)度而定，1 kb·min-1），共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

2?結(jié)果與分析

2.1?OsTZF3基因的生物信息學(xué)分析及gRNA靶序列的設(shè)計(jì)

水稻OsTZF3基因包含1個(gè)外顯子，CDS全長(zhǎng)2250 bp，編碼749個(gè)氨基酸，含有1個(gè)CHCH和1個(gè)TZF模體。將其CDS序列輸入CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)軟件（http：//www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html）獲得一系列g(shù)RNA靶序列（長(zhǎng)度為20 bp），選取位于TZF模體上游的靶序列，在NCBI中進(jìn)行同源比對(duì)分析，確定了1條與水稻基因組中其他序列同源性較低的gRNA靶序列5′AGCCACCAGACGCCGCACAG 3′，在該gRNA靶序列5′末端加上接頭CAG，其反向互補(bǔ)序列5′末端加上接頭AAC，構(gòu)成1對(duì)完整的gRNA靶點(diǎn)引物，并送往上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

2.2?CRISPR/Cas9敲除載體的獲得

將上述合成的gRNA靶點(diǎn)正反義引物按照材料與方法1.4所述，首先引物經(jīng)過(guò)變性退火形成具有黏性末端的引物二聚體，然后與具有同樣黏性末端的線性骨架載體VK00501連接，通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑單克隆測(cè)序獲得了gRNA 在CRISPR/Cas9骨架載體中正確插入的重組子，命名為pKTZF3，進(jìn)一步通過(guò)電激法將構(gòu)建正確的重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞LBA4404，經(jīng)過(guò)菌液PCR鑒定正確的單菌落，保存于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3?過(guò)表達(dá)載體 pCXUNTZF3的獲得

設(shè)計(jì)OsTZF3基因全長(zhǎng)引物TZF3F和TZF3R（表1），以日本晴基因組DNA為模板，用高保真酶（TaKaRa）PCR擴(kuò)增獲得OsTZF3基因全長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物膠回收后用普通Taq酶加A尾巴，通過(guò)TA克隆方法與pCXUN線性載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂布于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上。挑單菌落搖菌提質(zhì)粒后，經(jīng)酶切鑒定獲得正向連接的重組載體，并送往公司測(cè)序，獲得序列正確的載體，命名為pCXUNTZF3。電激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞LBA4404，使用菌液PCR擴(kuò)增目的基因，能獲得目的片段的單菌落保存于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4?農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pKTZF3轉(zhuǎn)化到粳稻日本晴胚性愈傷組織中，獲得了轉(zhuǎn)化再生植株55個(gè)克隆，CTAB法提取每個(gè)再生植株基因組DNA，用表1的CZF和CZR引物PCR擴(kuò)增，其中35個(gè)克隆能擴(kuò)增出目的條帶。進(jìn)一步對(duì)上述能擴(kuò)增出目的條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示所有PCR陽(yáng)性植株均含有本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的gRNA靶序列，說(shuō)明了gRNA靶序列成功導(dǎo)入水稻基因組中。同時(shí)，以上述鑒定的35個(gè)克隆轉(zhuǎn)基因植株為模板，用KTZF3F2 和KTZF3R2引物PCR擴(kuò)增靶突變區(qū)，送往公司測(cè)序發(fā)現(xiàn)35個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中均未檢測(cè)到靶基因突變，暗示了該gRNA序列的活性低或不具有活性。

另外，將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)載體pCXUNTZF3轉(zhuǎn)化粳稻日本晴胚性愈傷組織，共獲得轉(zhuǎn)化再生植株42個(gè)克隆，CTAB法提取再生植株基因組DNA，用UbiF和KTZF3R2引物PCR擴(kuò)增其中10個(gè)田間種植成活的轉(zhuǎn)化再生植株，結(jié)果顯示均能擴(kuò)增出預(yù)期條帶，說(shuō)明成功獲得了OsTZF3基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻。

3?討論與結(jié)論

植物RRTZF型鋅指蛋白基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫反應(yīng)中起著重要的作用。在擬南芥的RRTZF型鋅指蛋白基因的功能研究中發(fā)現(xiàn)此類基因具有功能冗余現(xiàn)象，過(guò)量表達(dá)是功能冗余基因分析的常用方法，但過(guò)量表達(dá)容易出現(xiàn)異位表達(dá)，基因敲除克服RNAi擬敲除技術(shù)抑制不徹底的缺陷，因此過(guò)量表達(dá)技術(shù)結(jié)合基因敲除技術(shù)可以更準(zhǔn)確地反映冗余基因的功能。本研究成功構(gòu)建了水稻RRTZF型鋅指蛋白基因OsTZF3敲除表達(dá)載體和過(guò)量表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，獲得了35個(gè)轉(zhuǎn)敲除載體的轉(zhuǎn)基因水稻和10個(gè)克隆的轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因水稻，為進(jìn)一步研究OsTZF3基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

CRISPR/Cas9技術(shù)是近年新興的一項(xiàng)切割效率極高的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，是基因功能研究中的一種非常有效的工具。雖然該CRISPR/Cas9系統(tǒng)幾乎能剪切PAM序列（NGG）之前的任何序列，但對(duì)于預(yù)測(cè)的所有靶位點(diǎn)并不是總能成功進(jìn)行編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的切割效率受到gRNA的影響，Liang等[9]認(rèn)為植物中有活性的gRNA序列具有以下4個(gè)特點(diǎn)：①gRNA序列G/C含量為30%～80%;②gRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)除莖環(huán)1外，其他結(jié)構(gòu)必須完整;③與其他gRNA序列的同源性12個(gè)堿基，保守區(qū)小于或等于7個(gè)堿基;④gRNA序列自身堿基配對(duì)小于或等于6個(gè)。本研究對(duì)OsTZF3基因的gRNA序列進(jìn)行分析，雖然gRNA序列均滿足上述有活性gRNA序列特點(diǎn)，但對(duì)其獲得的35個(gè)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行靶突變區(qū)檢測(cè)卻未發(fā)現(xiàn)突變體。由于植物基因組編輯需要花較長(zhǎng)時(shí)間才能獲得轉(zhuǎn)基因植株，因此除了對(duì)gRNA序列進(jìn)行評(píng)估外，還需多設(shè)計(jì)幾個(gè)gRNA序列，以保證獲得具有靶基因突變的植株。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）