劉欣欣 孫華磊 葛惠娜 王騰 李文杰

摘 要：目的：研究紫檀芪對2型糖尿病大鼠腎臟的影響。方法：采用高糖高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲菌素構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型。將大鼠隨機(jī)分為正常對照組、2型糖尿病組、紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組。干預(yù)7w后，檢測大鼠血糖和血脂的變化，測定腎功能指標(biāo)血尿素氮和血肌酐的含量及腎臟氧化應(yīng)激水平，取腎臟組織做HE染色，觀察大鼠腎組織病理學(xué)變化。結(jié)果：2型糖尿病組大鼠血糖、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平升高，低密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平降低;血尿素氮和血肌酐升高;腎臟組織的超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，丙二醛（MDA）水平升高;腎組織局部可見大量炎性細(xì)胞灶性浸潤，炎癥灶周圍腎小管上皮細(xì)胞廣泛水腫。紫檀芪干預(yù)后，血糖、TG、TC、LDL-C水平降低;血尿素氮和血肌酐降低;腎臟組織的SOD活性升高，MDA水平下降;腎小球和腎小管病變減輕。結(jié)論：紫檀芪能夠降低血糖和血脂、血尿素氮和血肌酐，改善腎臟的病理損傷，對2型糖尿病大鼠腎臟的損傷具有一定的治療作用。

關(guān)鍵詞：2型糖尿病;紫檀芪;腎臟

2型糖尿病占所有糖尿病的比例為93.7%。中國已成為2型糖尿病患病率增長較快的國家之一，每年大約新增100萬2型糖尿病患者。預(yù)防和控制2型糖尿病及其慢性并發(fā)癥是世界各國面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1-2]。

紫檀芪（pterostilbene，PTE）是一種廣泛存在于天然產(chǎn)物中的二苯乙烯類化合物，主要提取自藍(lán)莓和葡萄籽，有研究證明，紫檀芪為中國珍稀傳統(tǒng)中藥龍血竭的主要成分之一[3]。已有研究表明，紫檀芪具有抗氧化及調(diào)節(jié)糖、脂代謝異常的作用[4-6]。然而紫檀芪對2型糖尿病的腎臟病變是否有影響目前尚未見報道。本研究通過對2型糖尿病大鼠進(jìn)行紫檀芪干預(yù)，觀察大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)的變化及腎臟的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，探討紫檀芪對2型糖尿病大鼠腎臟的影響，為紫檀芪進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

卓越360全自動生化分析儀，上?？迫A生物工程股份有限公司;羅氏血糖儀，羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司;甘油三酯測定試劑盒，中生北控生物科技有限公司;總膽固醇測定試劑盒，中生北控生物科技有限公司;高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒，中生北控生物科技有限公司;低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒，中生北控生物科技有限公司;尿素氮測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;肌酐測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;丙二醛（MDA）測定試劑盒;南京建成生物工程研究所;鏈脲佐菌素，美國Sigma公司;紫檀芪，上海士豐生物有限公司。

1.2 實驗動物及飼料

選取SPF級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠100只，由河南省實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院動物實驗中心。室溫為18～23℃，相對濕度為45%～55%，通風(fēng)良好，動物分籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，晝夜間隔12h。

普通飼料，由河南省實驗動物中心提供，高脂高糖飼料：59.5%普通粉狀飼料、20%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉。

1.3 實驗方法

1.3.1 2型糖尿病大鼠模型的建立及實驗分組 100只4w齡雄性SD大鼠，體重170～220g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，隨機(jī)選取10只作為正常對照組，給予普通飼料喂養(yǎng)，其余大鼠給予高脂高糖飼料。4w后夜間禁食12h，按40mg/kg劑量一次性空腹注射鏈脲佐菌素STZ溶液，制備2型糖尿病大鼠模型。正常對照組大鼠腹腔注射相等體積的檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ72h后，尾靜脈采血檢測大鼠空腹血糖，若空腹血糖≥11.1mmol/L，并且出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀即為造模成功[7-8]。按上述成膜標(biāo)準(zhǔn)篩選出75只大鼠，造模成功率為83.3%。隨機(jī)選取造模成功的大鼠分為2型糖尿病組、紫檀芪低劑量干預(yù)組（20mg/kg）、紫檀芪中劑量干預(yù)組（40mg/kg）、紫檀芪高劑量干預(yù)組（80mg/kg），各10只，于每日固定時間按照體重計算灌胃劑量進(jìn)行灌胃1次。正常對照組和2型糖尿病組于每日固定時間給予羧甲基纖維素鈉溶液灌胃1次。連續(xù)干預(yù)7w后，腹腔主動脈取血測定各項生化指標(biāo)。

1.3.2 血糖和血脂的測定 采用全自動生化分析儀檢測血糖和血脂各項指標(biāo)，檢測方法參照試劑盒說明，空腹血糖（FBG）測定采用葡萄糖氧化酶法，甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）測定采用一點終點法，低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定采用兩點重點法，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定采用過氧化氫酶清除法。

1.3.3 血尿素氮和血肌酐的檢測 干預(yù)7w后，采用脲酶法測定血清中尿素氮（SCr）的含量，肌氨酸氧化酶法測定血清中肌酐（BUN）的水平，操作步驟參照試劑盒說明。

1.3.4 腎臟組織氧化應(yīng)激水平的測定 血樣采集完畢，斷頭處死大鼠，取出腎臟組織，將部分腎臟組織加入PBS中研磨成10%的組織勻漿，3 000r/min離心10min，取上清，采用Bradford法測定蛋白含量，以黃嘌呤氧化酶法檢測SOD 活性，硫代巴比妥酸染色法檢測MDA含量，操作步驟參照試劑盒說明。

1.3.5 腎臟形態(tài)學(xué)的觀察 首先用PBS緩沖液沖洗腎臟組織，然后用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，中性樹脂封片后于顯微鏡下觀察。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示，多組間均值比較采用單因素方差分析，組間兩兩數(shù)值比較用LSD法，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫檀芪對各組大鼠血糖、血脂的影響

前期實驗結(jié)果[8]表明，干預(yù)7w后，與正常對照組相比，2型糖尿病組大鼠FBG、TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與2型糖尿病組相比，紫檀芪低劑量組和中劑量組的FBG降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）;紫檀芪低劑量組、中劑量組和高劑量組TG水平降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）;紫檀芪低劑量組和中劑量組大鼠TC、LDL-C水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。紫檀芪低劑量組、中劑量組和高劑量組HDL-C水平與2型糖尿病組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（表1）。

2.2 紫檀芪對各組大鼠血尿素氮和血肌酐的影響

與正常對照組相比，2型糖尿病組大鼠中血清BUN和SCr值升高，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。與2型糖尿病組相比，紫檀芪低劑量干預(yù)組BUN值降低，紫檀芪低劑量、中劑量組SCr值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.3 紫檀芪對各組大鼠腎臟氧化應(yīng)激水平的影響

與正常對照組相比，2型糖尿病組大鼠腎臟組織的SOD活性下降，MDA水平升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。與2型糖尿病組相比，紫檀芪低劑量和中劑量干預(yù)組的SOD活性升高，MDA水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

2.4 紫檀芪對各組大鼠腎臟形態(tài)學(xué)的影響

如附圖所示，正常對照組中大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球、腎小管未見明顯病變。2型糖尿病組中腎組織局部可見大量炎性細(xì)胞灶性浸潤;炎癥灶內(nèi)腎小管結(jié)構(gòu)模糊或消失;炎癥灶周圍腎小管上皮細(xì)胞廣泛水腫，細(xì)胞腫脹，胞漿疏松淡染或呈空泡狀。紫檀芪低劑量干預(yù)組中，可見腎小球周圍較多炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主;炎癥灶內(nèi)少量腎小管結(jié)構(gòu)模糊;少量腎小管上皮細(xì)胞水腫，細(xì)胞腫脹，胞漿疏松淡染或呈空泡狀。紫檀芪中劑量干預(yù)組中，可見腎小球及血管周圍可見炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主;少量腎小管上皮細(xì)胞水腫，細(xì)胞腫脹，胞漿疏松淡染;血管肌細(xì)胞內(nèi)多可見呈空泡，將胞核擠壓成月牙狀。紫檀芪高劑量干預(yù)組中，可見血管周圍極少量炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主;極少量腎小管上皮細(xì)胞水腫。因此，不同劑量的紫檀芪對腎小球和腎小管的病變有不同程度的改善。

3 結(jié)論與討論

本課題通過高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量STZ的方式構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型。在2型糖尿病大鼠模型誘導(dǎo)成功后，給予不同劑量的紫檀芪進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫檀芪能夠降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂，此結(jié)果與文獻(xiàn)[5-6]等報道一致。糖尿病累及腎小球毛細(xì)血管，臨床表現(xiàn)為BUN和SCr的增高[9]。BUN為蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物，在人體通過腎小球過濾后隨尿液排出體外[10]。SCr為肌酸代謝的終末產(chǎn)物，主要經(jīng)腎小球濾過，在腎小管幾乎不被重吸收而流出體外[11]。在腎功能正常情況下，BUN和SCr從腎小球濾過，故作為腎小球濾過功能的診斷指標(biāo)。本研究中，2型糖尿病大鼠腎功能受損，腎小球濾過率下降，BUN和SCr升高。經(jīng)紫檀芪干預(yù)后，BUN和SCr有所下降，結(jié)果提示，紫檀芪可以提高腎小球濾過率。高血糖可誘導(dǎo)活性氧簇（ROS）的蓄積并導(dǎo)致氧化應(yīng)激，當(dāng)SOD活性降低時，自由基則攻擊細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞受損，MDA的含量間接反映組織的氧自由基含量和細(xì)胞損傷程度[12]。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)氧化與抗氧化系統(tǒng)異常時，其氧化能力顯著升高，甚至超越抗氧化能力，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟組織的氧化損傷[13]。本研究中，2型糖尿病組大鼠腎臟組織的SOD活性下降，MDA水平升高。紫檀芪干預(yù)后，腎臟組織的SOD活性升高，MDA水平下降。因此，應(yīng)用抗氧化劑紫檀芪干預(yù)2型糖尿病可改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而減輕氧化損傷，起到改善腎臟功能的作用。以往研究很少涉及紫檀芪對2型糖尿病腎臟功能的影響。2型糖尿病患者由于機(jī)體糖、脂代謝紊亂可以引起腎臟組織等實質(zhì)性器官的病變，隨著機(jī)體代謝異常的加劇，腎功能障礙加重，腎臟組織發(fā)生的器質(zhì)性病變能夠引發(fā)相應(yīng)的疾病。本研究還發(fā)現(xiàn)，紫檀芪可以改善2型糖尿病大鼠腎臟的病理變化，減少腎臟的腎小球和腎小管病變，起到緩解和改善腎臟功能的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，紫檀芪在改善2型糖尿病的糖、脂代謝紊亂的同時，也可緩解腎臟組織的病變。這可能與紫檀芪多靶點作用有關(guān)：紫檀芪可以激活過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-γ），還可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并能夠抑制炎癥反應(yīng)[4]。

綜上所述，紫檀芪可以降低2型糖尿病大鼠的血糖、血脂及BUN、SCr水平，并改善大鼠腎臟的組織形態(tài)，提示紫檀芪對2型糖尿病大鼠腎臟的損傷具有一定的治療作用，以上研究結(jié)果為紫檀芪作為天然活性物質(zhì)在功能食品研制和藥品開發(fā)方面提供科學(xué)依據(jù)。

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Abstract：Objective ?To explore the influence of pterostilbene on renal tissues of type 2 diabetic rats.Method ?Type 2 diabetes model（T2DM）was induced by high-fat and high-sugar diet combined with streptozotocin（40mg/kg）.Rats were randomly divided into normal control group，type 2 diabetes mellitus（T2DM）group，PTE low dose group，PTE middle dose group and PTE high dose group.After treatment of pterostilbene，fasting blood glucose（FBG）and blood lipid，BUN and SCr were examined，the activity of SOD and the level of MDA in renal tissues were evaluated，the morphology of kidney was observed.Result ?It was illustrated that FBG，TG，TC，LDL-C，BUN and SCr were increased，the activity of SOD reduced，and the level of MDA augmented in T2DM group.A large number of inflammatory cell infiltrated the renal tissues，and the extensive edema of renal tubular epithelial cells were found.After intervention，F(xiàn)BG，TG，TC，LDL-C，BUN and SCr were decreased，the activity of SOD increased，and the level of MDA reduced.The morphological change of kidney was relived.Conclusion ?Pterostilbene can reduce FBG and blood lipid，BUN and SCr，improve the pathological damage of kidney，therefore，have certain therapeutic effect on kidney in T2DM rats.

Keywords：type 2 diabetes;pterostilbene;renal tissue

（責(zé)任編輯 李婷婷）