魏明峰　張振旺

摘要：DNA條形編碼（DNAbarcoding）是一種快速、準確的生物分類技術，它是分子生物學和生物信息學相結(jié)合的產(chǎn)物。昆蟲種類繁多，近似物種鑒定困難使該技術在昆蟲分類工作中得到了廣泛應用。文章簡要綜述了DNA條形碼技術的概念、原理與操作步驟，詳細闡述了DNA條形碼技術在昆蟲分類研究中的具體應用情況，對其在應用過程中相比傳統(tǒng)形態(tài)分類方法的優(yōu)勢和存在問題予以論述，并探討了DNA條形碼技術今后在昆蟲分類中應用的可行性與發(fā)展前景。

關鍵詞：DNA條形碼;昆蟲分類學;研究進展

中圖分類號：Q969? 文獻標志碼：A? 論文編號：cjas18050009

0引言

DNA條形碼技術（DNA Barcoding）由分類學家Paul Hebert在21世紀初首次提出，作為分類學中一項輔助技術，它代表了一個新的發(fā)展方向，該技術的提出引起了越來越多生物學家的關注。在昆蟲分類學發(fā)展史中，DNA條形碼是自林奈雙名法以來最為突出的變革，不僅促進了昆蟲分類學和物種多樣性研究進程的發(fā)展，而且對種群生態(tài)學、物種遺傳學和個體分子系統(tǒng)發(fā)育等交叉學科的研究也起到積極的助推作用。

1 ?DNA條形碼概念

生命DNA條形碼協(xié)會將DNA條形碼定義為可以實現(xiàn)精準鑒定物種的一小段DNA標準序列。該技術通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析，利用線粒體細胞色素C氧化酶亞單位I（CO I）的特定標準區(qū)域做模板進行物種鑒定。概括地講，DNA條形碼核心技術是對已知的目標基因片段進行大范圍的掃描驗證，進而最終確定某個未知的物種或者發(fā)現(xiàn)新種。

2? DNA條形碼技術原理及操作過程

2.1? DNA條形碼技術應用原理

應用DNA條形碼的3個基本條件：（1）能夠得到待定物種的DNA特定序列，即被鑒定物種的DNA標準區(qū)域;（2）目標DNA序列信息容易進行鑒別分析;（3）目標DNA序列位點信息可以成功鑒定分析相似物種。如同商品零售業(yè)使用的條形編碼，各物種的DNA序列都具備唯一性。在DNA序列的組成上，每個位點都有4種堿基可供選擇，盡管由于自然選擇的因素，個別位點上的堿基是固定的，會導致編碼組合數(shù)減少，此現(xiàn)象可通過針對相關蛋白編碼基因予以解決。由于在蛋白編碼基因里密碼子的簡并性，其中第3位堿基通常不受自然選擇的影響，而且物種間的遺傳差異遠遠超過種內(nèi)變異，可采用基于CO I基因序列的DNA條形碼作為疑似昆蟲物種鑒定的有效手段。

2.2? DNA條形碼技術操作過程

通過PCR擴增和測序技術，對源自不同生物個體的同源DNA特定片段序列進行測序，然后對得到的DNA序列進行多重序列比對和聚類分析，從而將待定物種準確定位到一個己描述過的分類種群中。對某些物種來說，甚至可將其分布準確到特定的地理種群，具體包括以下幾個操作步驟：（1）樣品的采集與預處理，（2）提取樣本DNA，（3）DNA條形碼標準目的基因的擴增，（4）PCR產(chǎn)物的純化、序列測定以及分析。通過序列分析將所有序列進行雙重比對并計算其差異值，根據(jù)差異值即可確定物種之間的近源關系。

3? DNA條形碼技術在昆蟲分類學中的應用

DNA條形碼在昆蟲分類中的應用技術是建立在傳統(tǒng)形態(tài)分類學和現(xiàn)代分子技術基礎上的交叉學科應用范疇，體現(xiàn)在先通過傳統(tǒng)分類手段對物種個體有效特征進行形態(tài)上的識別和描述，而后隨著分子技術的應用，個體特征識別又得以補充和完善。Tautz等最先提出把DNA序列作為主要平臺應用于生物物種分類系統(tǒng)中，即DNA分類學（DNA Taxonomy）建立的雛形。Hebert等最先提出利用線粒體細胞色素C氧化酶I亞基（mtCO I）這一特定基因區(qū)段作為DNA條形編碼的基礎，對除刺胞動物門以外所有的動物界門，包括11個門13320個物種的CO I基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)此特定基因區(qū)段差異能夠很好地對被研究物種加以區(qū)分識別，故認為mtCO I是動物界中較為合適的DNA條形碼標準基因。昆蟲種類繁多，近似物種鑒定困難，DNA條形碼技術在昆蟲分類中已得到廣泛應用，截至2018年5月，BOLD數(shù)據(jù)庫已經(jīng)有超過400萬涉及昆蟲的條形碼記錄，超過整個動物界的70%以上，包括了183513個具體物種，其中已公開的有137048種（http：//www.barcodinglife.org）。DNA條形碼技術在分類研究中，最先在鱗翅目昆蟲中得到應用，Hebert等選取CO I基因的一段序列對200多個鱗翅目昆蟲種類進行識別，鑒定結(jié)果認為CO I基因的特定序列可以成功鑒定每個昆蟲個體。隨后，Hebert等又對2500多只哥斯達黎加普通蝴蝶（Astraptes fulgerator）進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蝴蝶的DNA條形編碼清楚地進入10個不同的組中，表明該復合體至少有10個隱存種，而在此之前這些蝴蝶被簡單地歸為一種，所以說單靠形態(tài)學特征不能對這些蝴蝶進行區(qū)分，也進一步證明DNA條形碼對發(fā)現(xiàn)隱存分類單元有極大幫助。Brown等結(jié)合形態(tài)分類學和DNA條形編碼技術，報道了巴布亞新幾內(nèi)亞的鱗翅目新種Xenothictis gnetivora。Hajibabaei等應用DNA條形碼技術對源自熱帶區(qū)域的多種鱗翅目昆蟲進行了識別。半翅目昆蟲中蚜蟲類應用較多，蚜蟲類昆蟲有超過4400種，而且轉(zhuǎn)主危害也增加了分類工作的難度。Favret和Voegtlin用小片段CO I基因序列鑒定形態(tài)學上難以鑒別的五節(jié)根蚜族蚜蟲的次生寄主型，結(jié)果表明這些不同寄主型也能被準確識別鑒定。Foottit等研究認為DNA條形編碼可以對寄居在不同宿主、不同生活周期的蚜蟲進行有效的物種鑒定，并且還揭示了蚜蟲的多樣性與蚜蟲生命周期具有一定相關性。煙粉虱是一種世界范圍災害性害蟲，各國紛紛對煙粉虱的生物型以及系統(tǒng)發(fā)育進行深入研究，研究證實，基于線粒體細胞色素氧化酶I（mtCO I）基因的差異能有效反映煙粉虱生物型的地理模式。另外，DNA條形碼技術在等翅目、彈尾目等昆蟲分類中均有應用。Ball和Hebert應用630 bp CO I基因序列對蜉蝣目昆蟲進行研究，結(jié)果顯示種內(nèi)和種間序列平均差異分別為1%和18%，證明DNA條形碼可以有效區(qū)分蜉蝣目昆蟲。在鞘翅目方面，Monaghan等在對馬達加斯加熱帶水生甲蟲的研究中，應用DNA序列在鑒定已記述種的同時發(fā)現(xiàn)了幾個隱存種。

隨著國際上DNA條形碼技術在昆蟲分類中的廣泛應用，國內(nèi)分類學者也開始關注該技術，肖金花等、王鑫等、王劍峰等、李青青等、池宇等、張媛等分別對DNA條形碼技術及其在相關學科中的應用進行了綜述。諸立新等基于CO I基因約640 bp片段序列的遺傳距離分析，對尾鳳蝶屬（Bhutanitis）4種蝴蝶的20個標本進行了鑒定。潘程瑩等以7種常見的斑腿蝗科（Catantopidae）蝗蟲為對象測定了CO I基因序列，探討了CO I基因作為DNA條形碼在鑒別蝗蟲物種的可行性。游中華等通過應用CO I基因，對生物入侵種西花薊馬（Frankliniella occidentalis）及其他8種常見薊馬進行了鑒定。李敏等通過擴增中國普緣蝽屬（Plinachtus）4個已知種的CO I（1338 bp）序列，計算了種間/種內(nèi)的遺傳距離。羅晨等利用mtDNACO I基因序列鑒定了國內(nèi)煙粉虱（Bemisia tabac）的生物型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個煙粉虱實驗種群的生物型與Texas-B型和Arizona-B型種群為同一生物型“B”。褚棟等利用CO I基因片段對國內(nèi)外12個地理種群煙粉虱的生物型進行了鑒定，并對地理種群來源進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國主要省市發(fā)生的煙粉虱與國外的B型煙粉虱具有99.8%?100%的同源性，從而確定了在中國大多數(shù)地區(qū)暴發(fā)成災的煙粉虱生物型為“B”型。截至2013年8月，BOLD數(shù)據(jù)庫已有煙粉虱標本記錄1557個，DNA條形碼記錄1427個，其中CO I>500 bp的記錄有945個。楊立等通過對隸屬3科10屬12種的嗜尸性蒼蠅線粒體DNA上細胞色素氧化酶亞單位I（mtCO I）中278 bp基因序列進行檢測，證實了mtDNA上CO I中278 bp基因序列能準確地對嗜尸性蒼蠅進行種類鑒定。范京安等選用雙翅目實蠅科（Tephritidae）12屬36種55個樣本為材料，將其DNA條形碼（648 bp）與微型DNA條形碼（50?200 bp）數(shù)據(jù)進行比較分析，探討微型DNA條形碼對果實蠅物種鑒定的可行性，虛擬實驗結(jié)果顯示微型DNA條形碼與DNA條形碼鑒定結(jié)果一致，兩者均可作為實蠅物種鑒定的可靠依據(jù)。

4? DNA條形碼技術在應用中的優(yōu)點及存在問題

與傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法相比，DNA條形碼技術具有以下優(yōu)點：（1）準確性高，親緣較近的不同物種外形極其相似，而形態(tài)鑒別容易導致鑒定誤差，利用堿基序列通過數(shù)字化進行物種鑒別，能夠準確區(qū)分相似物種;（2）快速迅捷，目前世界上已定名的昆蟲僅占一小部分，今后分類學家可參考DNA條形碼數(shù)據(jù)庫來鑒別或發(fā)現(xiàn)新種，使大量繁瑣的鑒定工作變得更加快捷;（3）非專業(yè)鑒定，由于該技術是一套機械程序，即使無分類學專業(yè)知識的研究人員也可以準確地進行物種辨認;（4）適用昆蟲的不同生長階段，相比需要成蟲為對象的傳統(tǒng)鑒定方法擴大了樣本范圍;（5）不需要特定的組織材料，因為同一個體或同種昆蟲不同個體的同源DNA序列是高度一致的。

盡管DNA條形碼技術具有上述優(yōu)勢，但單一位點特定序列鑒定的特點使其略顯不足，依目前的技術手段還不能完全取代傳統(tǒng)形態(tài)分類地位。一個新物種的命名和描述不是僅提供一個條形碼就可以完成，對于地球上節(jié)肢動物的多樣性，除了依賴DNA條形碼，對于昆蟲的寄主類型、危害特征、形態(tài)描述、地理分布以及行為特征的描述都是非常必要的。其存在問題表現(xiàn)在以下方面：（1）需根據(jù)目標產(chǎn)物的大小設計相應PCR條件，研究者應對條形碼使用的基因區(qū)域足夠了解，而且應分層次（屬、種等）尋找適合的條形碼;（2）不同物種間線粒體基因水平轉(zhuǎn)移、近緣物種共享線粒體表現(xiàn)出的多態(tài)性都會給鑒定增加困難，同屬物種間的差異不顯著以及DNA序列突變也給物種鑒定工作帶來困擾;（3）對物種進行地理種群和系統(tǒng)發(fā)育學分析時經(jīng)常會得到結(jié)論有時會與形態(tài)學研究結(jié)果有所偏差，如何界定物種分化水平一直是動物分類學家爭論的焦點，鑒于物種的界定在一定程度上受人為影響，線粒體DNA在生物系統(tǒng)地理學研究中的局限性將是今后研究人員面臨的關鍵問題;（4）參與研究單位少和研究領域不集中，數(shù)據(jù)共享不足;（5）利用DNA條形碼代價高，要建立條形編碼數(shù)據(jù)庫需要獲取到DNA樣品，一方面破壞模式標本提取DNA在一定角度上不可取，另一方面用新模標本替代原有模式標本雖然可行，但又面臨新新模標本的采集和鑒定等問題。

5? DNA條形碼技術的研究展望

目前，DNA條形碼技術研究方向及應用主要包括DNA提取方法和測序技術的優(yōu)化、探究微型條形碼鑒定技術、利用條形碼信息設計相應芯片、基于條形碼技術設計生產(chǎn)便攜式鑒定分析掃描儀，而作為精準的分類手段和工具不能局限于現(xiàn)行通用的分子標記，應該大膽嘗試和發(fā)現(xiàn)一些新的有可能解決疑難問題的關鍵功能基因。隨著此技術的快速發(fā)展，DNA條形編碼對昆蟲多樣性研究將起到越來越重要的作用，包括種類的區(qū)別和鑒定，發(fā)現(xiàn)新種和隱存種，重建物種和高級階元的系統(tǒng)發(fā)育關系等。

全世界的昆蟲可能有1000萬種，而目前世界上已定名的僅有100萬種，所以說在昆蟲分類研究中，DNA條形碼技術將有長足的發(fā)展和應用空間。而且隨著測序技術的更新和大數(shù)據(jù)時代海量數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，通過構(gòu)建包含所有發(fā)現(xiàn)物種DNA信息的條形碼序列數(shù)據(jù)庫，DNA條形碼技術鑒定成本低、速度快、結(jié)果精確，必將成為生物分類學最實效的技術手段、直接的信息資源及鑒定依據(jù)。例如在農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)中針對外來入侵種的檢疫，如能構(gòu)建一套涉及所有有害物種的DNA條形碼芯片系統(tǒng)，并且有從各物種及生命狀態(tài)中提取DNA的相應方法，可最大限度提高鑒定準確率，并加快進出口部門對有害生物的鑒定過程，避免檢疫對象的蔓延和發(fā)生危害。在傳統(tǒng)分類學發(fā)展的基礎上，系統(tǒng)分類學和生物技術的有機結(jié)合勢必帶動生命科學的多元化發(fā)展，DNA條形碼技術快速準確的鑒定物種將成為昆蟲分類學研究的必然趨勢。

綜上所述，作為一種標準的物種鑒定方法，DNA條形碼技術可靠、快速、簡便等優(yōu)勢使其在生物分類學、生物多樣性研究等領域具備了巨大的研究及應用潛力。隨著DNA條形碼技術的不斷更新和完善，將形成并建立各物種便捷的標準化測序系統(tǒng)，進而構(gòu)建DNA條形碼序列數(shù)據(jù)庫，為物種鑒別提供可靠的信息資源及鑒定依據(jù)。

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