王兵 廖勇仕 謝娟 鄧杰 陳平 郭英

【關(guān)鍵詞】 膠質(zhì)瘤;電壓門控氯通道3;侵襲; 遷移

Chloride channel-3 promotes invasion and migration of glioma cells Wang Bing， Liao Yongshi， Xie Juan， Deng Jie， Chen Ping， Guo Ying. Department of Neurosurgery， the Second Hospital， University of South China， Hengyang 421001， China

【Abstract】 Objective To investigate the expression and effect of chloride channel-3 （CLC-3） on the invasion and migration of human glioma cells. ?Methods Immunohistochemical staining was adopted to detect the expression of CLC-3 protein in the pathological sections of 30 glioma patients with complete data and brain specimens from 6 non-glioma normal subjects. The expression of CLC-3 in the U87MG cell lines was down-regulated by ShCLC-3 interfering adenovirus. The invasion and migration of glioma cells were detected by Transwell invasion and migration assay. The detection results were statistically analyzed. ?Results According to the pathological grading criteria of glioma by WHO， 6 cases were classified as grade Ⅰ， 9 cases of gradeⅡ， 7 cases of grade Ⅲ and 8 cases of grade Ⅳ. CLC-3 was stained as yellow or brown in the high-grade glioma （grade Ⅲ-Ⅳ）， light yellow or yellow in the low-grade glioma （grade Ⅰ-Ⅱ）. In the normal brain cells， CLC-3 was not stained in 1 case， and light yellow in the remaining 5 cases. The expression of CLC-3 protein was not significantly correlated with gender or age （both P > 0.05）. Spearman rank correlation analysis demonstrated that the expression of CLC-3 was positively correlated with WHO pathological grading of glioma （rs = 0.782， P < 0.001）. The expression of CLC-3 was significantly down-regulated in U87MG cells after the cells were infected by the ShCLC-3 adenovirus， and the invasion and migration abilities of glioma cells were significantly reduced （both P < 0.05）. ?Conclusions CLC-3 is highly expressed in the pathological specimens of glioma， which is positively correlated with pathological grading of glioma. CLC-3 can promote the invasion and migration of glioma cells.

【Key words】 Glioma;Chloride channel-3;Invasion;Migration

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的和高侵襲性的原發(fā)性惡性腫瘤，即使聯(lián)合手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療等綜合治療，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然很差。惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的中位生存期為12 ～ 15個(gè)月[1]。導(dǎo)致膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良的主要原因是其高度侵襲性，目前分子機(jī)制仍未清楚[2]。最近的研究表明離子通道在腫瘤的惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮了重要作用。電壓門控氯通道3（CLC-3）是CLC家族的成員之一，被認(rèn)為是容積調(diào)節(jié)性氯通道的重要組分部分，廣泛參與細(xì)胞容積調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)等多種病理生理過(guò)程[3-5]。CLC-3在鼻咽癌、宮頸癌等多種腫瘤中的作用已被證實(shí)[6]。近年來(lái)有關(guān)膠質(zhì)瘤與CLC-3的研究亦有報(bào)道，但CLC-3在不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及作用仍未明確。在本研究中，筆者通過(guò)檢測(cè)30例不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤標(biāo)本中CLC-3的表達(dá)，以及分析短發(fā)夾靶向人CLC-3序列（ShCLC-3）干擾腺病毒下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株CLC-3表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲遷移情況，以明確CLC-3在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及CLC-3在膠質(zhì)瘤侵襲遷移中的作用，以期為CLC-3作為膠質(zhì)瘤治療的靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、主要試劑

CLC-3單抗（英國(guó)Abcam公司）、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG和SNB19（ATCC， Microbix公司）、生物素化羊抗兔二抗（美國(guó)Vector Laboratories）、SP法免疫組化試劑盒（中國(guó)中衫金橋）、DAB顯色試劑（美國(guó)DAKO公司）、50×EDTA修復(fù)液（美國(guó)DAKO公司）、Triton-Xl（北京泰澤瑞達(dá)公司）、蘇木素染色劑（美國(guó)DACO公司）、檸檬酸抗原修復(fù)工作液（北京中衫金橋公司）、Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BGA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（中國(guó)碧云天）、PVDF膜（美國(guó)Pierce公司）、ECL（美國(guó)Pierce公司）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（中國(guó)碧云天）、考馬斯亮藍(lán)快速染色液（中國(guó)碧云天）0.1 % Fibronectin（美國(guó)Sigma公司）、BSA（美國(guó)Amresco公司）、RPMI1640（美國(guó)HyClone公司）、HEPES（美國(guó)Sigma公司）、胎牛血清（美國(guó)HyClone公司）、PVDF膜（美國(guó)Pierce公司）Transwell小室（膜）（美國(guó)，Transwell）。

二、材 料

選取于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)外科通過(guò)手術(shù)切除的30例臨床及病理資料完整的膠質(zhì)瘤患者的石蠟包埋標(biāo)本，其中男19例、女11例，年齡（52.0±13.6）歲。所有患者術(shù)前未接受任何放射或化學(xué)治療。按WHO膠質(zhì)瘤病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)：Ⅰ級(jí)6例（毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤）、Ⅱ級(jí)9例（彌漫型星形細(xì)胞瘤）、Ⅲ級(jí)7例（間變型星形細(xì)胞瘤）、Ⅳ級(jí)8例（原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤）。另選取于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院因外傷或出血行開(kāi)顱手術(shù)的6例患者的正常腦組織標(biāo)本（由手術(shù)入路獲得）作為對(duì)照。膠質(zhì)瘤組織和對(duì)照組織經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，制成4 mm

厚片備染。所有標(biāo)本行蘇木素-伊紅染色（HE染色）確認(rèn)后行免疫組織化學(xué)（免疫組化）檢測(cè)。所有標(biāo)本均經(jīng)2位病理科醫(yī)師檢測(cè)確診。本研究獲得中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

三、免疫組化

使用標(biāo)準(zhǔn)鏈霉抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶復(fù)合物方法進(jìn)行免疫組化染色。染色結(jié)果通過(guò)顯微鏡觀察10個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及著色深淺判斷染色強(qiáng)度，染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3;陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分陰性為0分，≤25%為1分，26% ～ 50%為2分，51% ～ 75%為3分，≥76%為4分。每例細(xì)胞染色積分=染色強(qiáng)度評(píng)分+陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分。按照積分分值可將表達(dá)程度分為：陰性（-）0 ～ 1分;弱陽(yáng)性（+）2分;中度陽(yáng)性（++）3 ～ 4分;強(qiáng)陽(yáng)性（+++）5 ～ 7分。弱陽(yáng)性、中度陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)合稱為陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果由2位病理科醫(yī)師獨(dú)立評(píng)估確認(rèn)。

四、細(xì)胞培養(yǎng)

膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG在含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周，傳代2 ～ 3代。

五、沉默CLC-3表達(dá)腺病毒ShCLC-3的構(gòu)建

ShCLC-3（NM_00124 3374.1）為5’-CCACGACUGGUUUAUCUUUCUCAAGAGAAAAGAUAAACCAGUCGUGG-3’。對(duì)照加擾序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUUUCAAGAGAACGUGACACGUUCGGAGAA-3’。通過(guò)使用AdEasy系統(tǒng)（MP Biomedicals Inc.）產(chǎn)生高滴度的重組腺病毒感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG以敲低CLC-3的表達(dá)并通過(guò)蛋白免疫印跡檢測(cè)構(gòu)建效果。

六、Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

將胎牛血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞（2×104）添加在BioCoatTM侵襲室（BD）的上室中（分為腺病毒干擾CLC-3組及空病毒載體組），并在37℃孵育20 h，隨后除去細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞上部室與棉花棒。用甲醇固定在膜底部表面上遷移和侵入的細(xì)胞，用1%結(jié)晶紫染色并使用光學(xué)顯微鏡在放大倍數(shù)×100的5個(gè)隨機(jī)視野中計(jì)數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)過(guò)程與侵襲實(shí)驗(yàn)過(guò)程基本一致，不同的只是上室不需要鋪以Matrigel膠。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布計(jì)量資料用表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);等級(jí)資料用率表示，多組間比較用秩和檢驗(yàn);CLC-3的表達(dá)強(qiáng)度與WHO膠質(zhì)瘤病理分級(jí)間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P < 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CLC-3在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及與WHO膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的關(guān)系

高級(jí)別（Ⅲ ～ Ⅳ級(jí)）膠質(zhì)瘤細(xì)胞的染色呈明顯棕黃色或棕褐色，提示CLC-3高表達(dá);低級(jí)別（Ⅰ ～ Ⅱ）膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈淡黃色或棕黃色，提示CLC-3低表達(dá);正常腦細(xì)胞1例無(wú)著色，另外5例呈淡黃色，提示在正常腦細(xì)胞中CLC-3也呈低表達(dá)。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，CLC-3表達(dá)產(chǎn)物主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，在細(xì)胞核亦可見(jiàn)陽(yáng)性染色，見(jiàn)圖1、表1。

上述結(jié)果提示CLC-3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，進(jìn)一步對(duì)CLC-3的表達(dá)量與不同WHO膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的相關(guān)性進(jìn)行研究，CLC-3在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.001），見(jiàn)表2。進(jìn)一步行Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示CLC-3的表達(dá)與WHO膠質(zhì)瘤病理分級(jí)呈正相關(guān)（rs= 0.782 、P < 0.001）。

二、抑制CLC-3表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞的侵襲和遷移能力的影響

1. ShCLC-3腺病毒載體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87-MG中CLC-3表達(dá)的影響

ShCLC-3腺病毒可明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG中CLC-3蛋白的表達(dá)水平，見(jiàn)圖2。

2. 抑制CLC-3表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG侵襲和遷移能力的影響

抑制CLC-3表達(dá)后，通過(guò)Transwell 小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。進(jìn)一步行細(xì)胞計(jì)數(shù)，空病毒載體組與腺病毒干擾CLC-3組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n = 6，t分別為20.684、24.245，P均< 0.05）。提示抑制CLC-3表達(dá)后膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞的侵襲和遷移能力減弱，見(jiàn)圖3。

討 論

CLC-3已被證實(shí)在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并與腫瘤的侵襲性相關(guān)。我們的研究表明CLC-3在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，并與其病理分級(jí)呈正相關(guān);抑制CLC-3的表達(dá)可使膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的侵襲和遷移能力減弱，提示CLC-3或可作為治療膠質(zhì)瘤的一種潛在靶標(biāo)。

膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)與其他實(shí)體腫瘤不同，腫瘤細(xì)胞在顱內(nèi)受限空間內(nèi)沿腦組織間隙侵襲性生長(zhǎng)，而瘤周是低滲水腫環(huán)境，暴露于這種低滲水腫環(huán)境下的細(xì)胞如果不能主動(dòng)調(diào)節(jié)容積改變，就會(huì)發(fā)生持續(xù)性膨脹，表現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制，甚至發(fā)生細(xì)胞凋亡[7-8]。這些環(huán)境特點(diǎn)需要膠質(zhì)瘤較其他實(shí)體腫瘤具有更強(qiáng)的細(xì)胞容積調(diào)節(jié)能力及形變能力。研究證實(shí)低滲環(huán)境下，星形膠質(zhì)細(xì)胞僅可實(shí)現(xiàn)容積的部分恢復(fù)，而膠質(zhì)瘤細(xì)胞可調(diào)節(jié)細(xì)胞恢復(fù)原有的甚至更小的容積[9]。原位圖像顯示侵襲的膠質(zhì)瘤細(xì)胞通常呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的紡錘形形態(tài)黏附于血管上[10]。細(xì)胞對(duì)容積的調(diào)節(jié)是通過(guò)細(xì)胞膜上離子通道和離子交換體來(lái)實(shí)現(xiàn)的[11]。作為細(xì)胞內(nèi)、外液中最主要的陰離子，氯離子被認(rèn)為是參與調(diào)節(jié)性細(xì)胞容積回縮過(guò)程的主要溶質(zhì)，大多數(shù)細(xì)胞膨脹會(huì)導(dǎo)致氯通道的活化[12-13]。CLC-3，一種電壓依賴性氯離子通道，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞容積調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。臨床中我們?？吹侥z質(zhì)瘤瘤周水腫隨著病理級(jí)別的升高而明顯加重，低級(jí)別膠質(zhì)瘤瘤周無(wú)明顯水腫或僅有輕度水腫，高級(jí)別膠質(zhì)瘤尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤瘤周水腫非常明顯。在低滲水腫環(huán)境下，膠質(zhì)瘤細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的增殖和侵襲能力，其機(jī)制目前仍未清楚。我們的研究顯示CLC-3在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，高表達(dá)的CLC-3主要分布在細(xì)胞膜上，且與WHO膠質(zhì)瘤病理分級(jí)呈正相關(guān)，高表達(dá)的CLC-3可促進(jìn)膠質(zhì)瘤的侵襲和遷移，提示CLC-3在其中發(fā)揮了重要作用，瘤周低滲水腫環(huán)境下的細(xì)胞膨脹可能是膠質(zhì)瘤細(xì)胞CLC-3激活和高表達(dá)的啟動(dòng)因子。

CLC-3促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的機(jī)制目前尚未清楚。研究表明CLC-3可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞體積在細(xì)胞遷移和侵襲中起關(guān)鍵作用[6]。CLC-3介導(dǎo)氯離子的分泌以及水的排出，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞體積改變和形狀適應(yīng)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵入狹窄和曲折的細(xì)胞外空間。有研究顯示，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和膠質(zhì)瘤患者樣本中，細(xì)胞膜上的CLC-3蛋白均上調(diào)[14]。CLC-3與大電導(dǎo)鈣激活性鉀通道（BK通道）共定位于膠質(zhì)瘤細(xì)胞，BK通道是神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞鉀離子流出的主要途徑，其激活是膠質(zhì)瘤遷移所必需的[10， 15]。這種共定位表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞協(xié)調(diào)的離子通道動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)前導(dǎo)過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞入侵。臨床上常見(jiàn)的腫瘤周圍腦水腫隨著膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的增加而明顯增加[16]。研究顯示腫瘤周圍腦水腫是影響膠質(zhì)瘤發(fā)病率和病死率的重要原因[17]。目前仍缺乏合理的機(jī)制解釋，我們的研究結(jié)果提供了一種新的分子機(jī)制解釋。

綜上所述，CLC-3在膠質(zhì)瘤的侵襲遷移中發(fā)揮了重要作用，但其機(jī)制目前仍未清楚，是否僅通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞容積促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移，還是存在其他途徑，我們的課題組將行進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-01-11）

（本文編輯：洪悅民）