呂海燕 李大衛(wèi) 鐘彩虹

摘 要：為有力推動(dòng)獼猴桃產(chǎn)業(yè)化種苗生產(chǎn)及推廣，快速高效地繁育獼猴桃新種質(zhì)資源，同時(shí)為獼猴桃多倍體育種、轉(zhuǎn)基因育種等新興育種技術(shù)創(chuàng)造新種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)，該研究以‘東紅’獼猴桃葉片、葉柄為外植體，探討了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及質(zhì)量濃度組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中不定芽形成的影響，并研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)‘東紅’組培苗不定根誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：‘東紅’再生最佳外植體為葉柄，葉柄不定芽再生最佳培養(yǎng)基為MS + 0.5 μg·mL-1 6-BA + 0.2 μg·mL-1 NAA，不定芽平均再生率為91.2%;不定芽經(jīng)過(guò)壯苗培養(yǎng)（MS + 0.2 μg·mL-1 6-BA + 0.05 μg·mL-1 NAA），取2～3 cm高幼苗進(jìn)行生根誘導(dǎo)，不定根再生率為93%，平均根數(shù)為6條;生根后，種苗移栽成活率在80%以上。初步建立了‘東紅’葉柄高效再生體系，為獼猴桃快速的產(chǎn)業(yè)化種苗生產(chǎn)及推廣提供了有力保證，也為后期獼猴桃育種研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：獼猴桃， ‘東紅’， 再生體系， 葉柄， 移栽

中圖分類號(hào)：Q943.1， Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2019）04-0464-08

Abstract：In order to promote the massive seedling industrialization and popularization of Actinidia chinensis， and multiply the new seedling resources fast and effectively， and lay foundation for the genetic transformation of kiwifruit，? the petioles and leaves of A. chinensis ‘Donghong’ were chosen as explants， and the effects ofdifferent plant growth regulators on frequencies of callus formation and adventitious bud regeneration were investigated by culturing on the induction medium. Moreover， the influence ofdifferent types of plant growth regulators on the induction of adventitious roots was also analyzed. The results showed that the combination ofdifferent concentrations of 6-BA and NAA had strong effect on the bud regeneration rate， and the optimum combination （MS + 0.5 μg·mL-1 6-BA + 0.2 μg·mL-1 NAA） were obtained， in which the frequency of bud regeneration from leaves and petioles reached 63.4% and 91.2% after 35d culture， respectively. The adventitious bud regeneration rate of petiole explant of A. chinensis ‘Donghong’ was significantly higher than that of leaf explant. The frequency of adventitious bud regeneration from petioles was up to 91.2% and the average amount of regenerated buds for each petiole explant was 9-12. The result suggested that IBA was much more effective than NAA for rooting. The best cencentration of IBA was 0.5 μg·mL-1， and the rate of adventitious root regeneration and the average number of roots per shoot were 93% and 6， respectively. More than 80% of plantlets survived after transplanting. This fast anddirectdiffe-rentiation simplified the process of adventitious bud formationdifferentiated from callus， which shortened the culture process and provided a powerful guarantee for the rapid industrialization of seedling production.

Key words：kiwifruit， Actinidia chinensis ‘Donghong’， regeneration system， petiole， transplanting

獼猴桃資源收集、品種選育始于20世紀(jì)初，經(jīng)過(guò)一百多年的生產(chǎn)、推廣、發(fā)展已在全球形成近24.5萬(wàn)hm2的種植規(guī)模，年產(chǎn)值已在百億以上。中國(guó)獼猴桃的大規(guī)模種植、生產(chǎn)始于20世紀(jì)70年代末，目前中國(guó)獼猴桃的種植面積和產(chǎn)量均躍居世界第一（張計(jì)育等，2014）。紅肉獼猴桃因其甜濃的風(fēng)味及豐富的營(yíng)養(yǎng)，在國(guó)內(nèi)外消費(fèi)市場(chǎng)上頗受消費(fèi)者的喜愛(ài)。從全球不同果肉顏色的獼猴桃種植面積來(lái)看，紅肉獼猴桃的種植面積還有進(jìn)一步的發(fā)展空間（齊秀娟等，2015）。中國(guó)科學(xué)院武漢植物園從‘紅陽(yáng)’開(kāi)放式授粉種子實(shí)生后代中，經(jīng)過(guò)15 a的種質(zhì)篩選培育獲得一個(gè)獼猴桃新品種——‘東紅’獼猴桃，該新品種于2012年12月通過(guò)品種審定（國(guó)S-SV-AC-031-2012）?！畺|紅’獼猴桃在風(fēng)味口感、可溶性固形物、維生素含量及耐儲(chǔ)性上都更優(yōu)于‘紅陽(yáng)’，集早熟、耐儲(chǔ)、優(yōu)質(zhì)為一體的紅肉獼猴桃新品種（黃宏文等，2000;黃宏文，2013）。

隨著中國(guó)獼猴桃新品種選育速度的加快，為了更快速地推廣新品種和保留新品種優(yōu)良品質(zhì)，采用獼猴桃的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行繁殖是最快速有效的方法之一。利用組織培養(yǎng)快速高效的繁育大量?jī)?yōu)質(zhì)獼猴桃種苗，將為加速獼猴桃優(yōu)良品種的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及推廣做出貢獻(xiàn)（隆前進(jìn)，2010）。近年來(lái)，有關(guān)獼猴桃組織培養(yǎng)技術(shù)的研究已獲得了重要進(jìn)展。獼猴桃花藥培養(yǎng)、離體胚培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)、葉片、莖段、根、葉柄等器官培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)及融合以及新興的生物技術(shù)育種都取得了很大的成效（劉錚等，2013;秦永華等，2004）。

基于對(duì)‘東紅’獼猴桃優(yōu)良性狀的保存及產(chǎn)業(yè)化種苗生產(chǎn)模式的探討，本研究以‘東紅’獼猴桃的葉片、葉柄為外植體，通過(guò)不定芽誘導(dǎo)和生根誘導(dǎo)試驗(yàn)，建立其快繁再生體系，為‘東紅’獼猴桃快速的產(chǎn)業(yè)化種苗生產(chǎn)及推廣提供有力保證，也為后期獼猴桃倍性育種及遺傳轉(zhuǎn)化育種研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年3月25日從中國(guó)科學(xué)院武漢植物園獼猴桃國(guó)家資源圃采集‘東紅’獼猴桃未木質(zhì)化的嫩枝。用自來(lái)水沖洗1 h，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡45 s，0.1%升汞10 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，然后切成1～2個(gè)腋芽的莖段，形態(tài)學(xué)下端插入MS + 1.0 μg·mL-1 6-BA + 0.2 μg·mL-1 NAA上，置于光培養(yǎng)室光下培養(yǎng)，12 h·d-1，（25 ± 2）℃，21～28d后調(diào)查腋芽萌發(fā)率，并以獲得的無(wú)菌試管苗為外植體來(lái)源進(jìn)行再生試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 不定芽的再生 切取試管苗完全展開(kāi)幼嫩葉片，0.5 cm × 0.5 cm，葉柄及主脈靠葉柄端單獨(dú)取出，切成0.5 cm小段，置于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同質(zhì)量濃度的6-BA，NAA，以不加任何激素的MS為對(duì)照，6-BA質(zhì)量濃度2.0、1.0、0.5 μg·mL-1，NAA質(zhì)量濃度0.1、0.2、0.4 μg·mL-1，隨機(jī)設(shè)置9個(gè)處理，加上對(duì)照共10個(gè)，每處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15個(gè)外植體。接種后置于光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)28d后統(tǒng)計(jì)不定芽和愈傷再生率，不定芽在最佳不定芽再生培養(yǎng)基上繼代一次后，轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 不定芽的生根 將生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)一致的高 2～3 cm，具3～4片葉的不定芽切下，分別接種到附加有不同質(zhì)量濃度的NAA、IBA的1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，以1/2MS為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)15個(gè)不定芽，培養(yǎng)21d后，統(tǒng)計(jì)生根率和平均生根數(shù)量。本研究的光培養(yǎng)條件為12 h·d-1光照，光照強(qiáng)度2 500 lx，溫度（25 ± 2） ℃，MS基本培養(yǎng)基添加蔗糖質(zhì)量濃度3×104 μg·mL-1，瓊脂質(zhì)量濃度7.5×103 μg·mL-1，pH 6.0。

1.2.3 種苗的馴化移栽 當(dāng)組培苗根長(zhǎng)1～2 cm時(shí)，將瓶苗取出至移栽溫室進(jìn)行馴化，2～3d后松瓶蓋，一周后取出生根苗，清水洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至裝有滅菌基質(zhì)（泥炭土∶草炭土∶珍珠巖=2∶1∶1）的穴盤中。移栽后一到兩周保證環(huán)境溫度20～30 ℃，空氣濕度70%～85%，夏季移栽適當(dāng)遮陰，兩周后可適當(dāng)過(guò)渡到常規(guī)管理。一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)種苗移栽成活率及生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行方差分析。

愈傷再生率=再生愈傷葉片數(shù)（葉柄數(shù)）/接種外植體總數(shù)×100%;不定芽再生率=再生芽葉片數(shù)（葉柄數(shù)）/接種外植體總數(shù)×100%;不定芽生根率=生根芽數(shù)/接種不定芽數(shù)量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度組合的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽形成的影響

外植體接入各處理培養(yǎng)基9～10d后，葉片和葉柄切口處都開(kāi)始膨大， 部分切口邊緣生成少量愈傷組織并隨之出現(xiàn)增殖生長(zhǎng)， 部分切口處直接再生出單個(gè)或芽叢狀不定芽。在培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA和NAA，結(jié)果表明不同配比的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)離體葉片和葉柄不定芽再生的影響很大。使用6-BA 0.5 μg·mL-1和NAA 0.2 μg·mL-1濃度組合可以顯著提高葉片和葉柄不定芽再生率，不定芽直接再生率可分別達(dá)到63.4%和91.2%，顯著高于其他處理（表1，表2）。

2.2 不同外植體類型對(duì)不定芽誘導(dǎo)的比較

以‘東紅’組培苗的葉片、葉柄為外植體對(duì)其分化能力進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在相同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的相同濃度誘導(dǎo)下葉柄的分化能力明顯好于葉片（圖1）。葉片愈傷組織分化率高，且形成的愈傷組織致密，不易分化，直接再生芽多為畸形芽，分化耗時(shí)長(zhǎng)，大部分葉片外植體分化形成了愈傷組織，影響了直接再生不定芽的進(jìn)程;葉柄直接再生不定芽多為叢芽， 分化快， 顏色亮綠色。因此，對(duì)‘東紅’來(lái)說(shuō)葉柄是更好的分化材料， 所以考慮選擇葉柄為‘東紅’不定芽再生的最佳外植體。

2.3 不同質(zhì)量濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽生根的影響

在‘東紅’再生培養(yǎng)最后的生根階段，為保證用于不定根誘導(dǎo)的不定芽狀態(tài)的相對(duì)一致，將再生芽接種至壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)35d后，選擇株高2～3 cm，葉片3～4片的不定芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)，接種到含不同質(zhì)量濃度的NAA和IBA的生根培養(yǎng)基7d后發(fā)現(xiàn)IBA 0.5 μg·mL-1最先產(chǎn)生不定根，隨后其他處理陸續(xù)有不定根產(chǎn)生，21d后統(tǒng)計(jì)不定根形成率。由表3可知，不同處理情況下不定芽生根率和平均根數(shù)存在顯著差異。1/2MS培養(yǎng)基附加IBA和NAA均可誘導(dǎo)生根。不同的是IBA誘導(dǎo)生根較早，第9天就能肉眼觀察到不定根，且不定根生長(zhǎng)粗壯，數(shù)量多，直接都是從不定芽基部生根，沒(méi)有愈傷組織的產(chǎn)生。而NAA誘導(dǎo)生根于不定芽基部容易形成愈傷組織再分化出不定根，但生出的根細(xì)長(zhǎng)，瘦弱。因此，1/2 MS + 0.5 μg·mL-1 IBA為‘東紅’最適生根培養(yǎng)基。

2.4 種苗移栽

組培種苗煉苗后移栽至滅菌后基質(zhì)中，20d后即有新葉長(zhǎng)出，30d后統(tǒng)計(jì)成活率在80%以上。生長(zhǎng)后期長(zhǎng)勢(shì)良好，70～90d后即可出圃，此時(shí)苗高12.5 cm，含6～8個(gè)飽滿芽（圖版I：E、F）。

3 討論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類及濃度是植物組織培養(yǎng)條件摸索的最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。在獼猴桃組織培養(yǎng)過(guò)程中研究應(yīng)用較多的的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有細(xì)胞分裂素如6-BA、ZT、KT、CPPU等，生長(zhǎng)素如NAA、2，4-D、IBA、IAA等（Muleo & Morini，1990;賈?；?，2010;劉小剛等，2013;朱學(xué)棟等，2012）。前人研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加1.0～2.0 μg·mL-1的ZT對(duì)獼猴桃組培再生及后期瓶苗的生根都有很顯著的促進(jìn)作用（謝志兵和魯旭東，2003;張遠(yuǎn)記和錢迎倩，1996）。細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素適宜濃度組合的培養(yǎng)基配方對(duì)獼猴桃組織培養(yǎng)過(guò)程中愈傷的分化及芽的再生有很好的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的6-BA和NAA組合能顯著促進(jìn)獼猴桃愈傷組織形成和不定芽的分化（田娜等，2007）。另有研究表明，不同濃度的6-BA 和NAA的組合處理比6-BA 和2，4-D的組合處理更顯著促進(jìn)獼猴桃莖段愈傷組織的分化（王大平，2007）。本研究以附加不同濃度的6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基對(duì)‘東紅’葉柄和葉片進(jìn)行不定芽的再生誘導(dǎo)，結(jié)果表明低濃度的6-BA 0.5 μg·mL-1和NAA 0.2 μg·mL-1的組合濃度處理對(duì)‘東紅’直接再生不定芽具有很好的效果，愈傷率低，器官分化直接進(jìn)行不定芽的再生階段，不定芽直接再生率高達(dá)91.2%。植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，低濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促進(jìn)生長(zhǎng)，而高濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑則抑制生長(zhǎng)，該原理在獼猴桃組織培養(yǎng)中也不例外，多以低濃度為宜，尤其在不定芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)階段（劉永立等，2005;胡皓和張志東，2011;袁云香，2011）。

獼猴桃組培苗的生根研究表明，添加常規(guī)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如IBA、NAA、IAA即可促進(jìn)其生根（李桂君等，2010;王大平和楊玲，2008;謝志兵和魯旭東，2003）。本研究結(jié)果表明‘東紅’不定芽在接種于添加0.5 μg·mL-1 IBA的1/2 MS中，誘導(dǎo)生根率最高，單株生根數(shù)量達(dá)6條，效果最優(yōu)。

外植體的篩選作為植物組織培養(yǎng)的第一步，其重要性直接影響培養(yǎng)后期的細(xì)胞再生與分化以至于芽的形成（陳洪國(guó)和熊月明，2001;姜維梅和李鳳玉，2003;隆前進(jìn)等，2010;周玲艷等，2007）。獼猴桃組織培養(yǎng)可供研究的外植體類型很多，帶腋芽的莖段、不定芽、葉柄、葉片、花瓣、花萼、花粉、胚乳、根、形成層和原生質(zhì)體均可成功誘導(dǎo)不定芽的再生（尚霄麗等，2010;劉長(zhǎng)江等，2009;田新華等，2008;文國(guó)琴和何震，2004;Gonzalez et al.，1995;Adam，1995;畢靜華等，2005;蘭大偉等，2007）。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉片在誘導(dǎo)分化過(guò)程中容易形成致密的不易分化的愈傷組織，少量直接再生的不定芽畸形芽偏多，而葉柄不定芽直接再生率顯著高于葉片，分化速度快，直接簡(jiǎn)化了從愈傷組織到不定芽分化的過(guò)程，縮短了育種進(jìn)程，為產(chǎn)業(yè)化快速生產(chǎn)種苗提供了有力的保證。

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