夏錄錄 李薇 梅文莉 楊理

摘 要：該文采用 ODS、硅膠、Sephadex LH-20 等柱色譜技術(shù)，對(duì)柬埔寨野生柯拉斯那沉香（Aquilaria crassna）進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：從柬埔寨柯拉斯那所產(chǎn)沉香的乙醇提取物中進(jìn)行分離共得到了10個(gè)化合物，包括一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體（9a/9b）。經(jīng)波譜解析分別鑒定為6-甲氧基-2- [2-（3-羥基-4-甲氧基苯）乙基]色酮（1）、6-甲氧基-2- [2-（3-甲氧基-4-羥基苯）乙基]色酮（2）、6，7-二甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮（3）、6-羥基-2-（2-苯乙基）色酮（4）、6-羥基-2- [2-（4-甲氧基苯）乙基]色酮（5）、8-氯-6-羥基-2- [2-（3-羥基-4-甲氧基苯）乙基]色酮（6）、8-氯-6-羥基-2- [2-（4-甲氧基苯）乙基]色酮（7）、oxidoagarochromone B（8）、4′-demethoxyaqusisnenoned（9）。其中，化合物6、7和9均為首次從柯拉斯那沉香中分離得到。活性測(cè)試結(jié)果顯示，化合物1和2對(duì)乙酰膽堿脂酶具有一定的抑制活性，化合物2對(duì)人慢性髓原白血病細(xì)胞K562具有較弱的抑制作用。

關(guān)鍵詞：柬埔寨， 沉香， 柯拉斯那， 化學(xué)成分， 乙酰膽堿脂酶抑制活性， 細(xì)胞毒活性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q946.91， R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2019）04-0540-08

Abstract：Ten compounds， including one pair of enantiomers （9a/9b）， were isolated from the ethanol extract of agarwood originating from Aquilaria crassna in Cambodia by comprehensive chromatographic techniques including ODS， silica gel and Sephadex LH-20. On the basis of spectroscopicdata， they were identified as 6-methoxy-2- [2-（3-hydroxy-4-methoxyphenyl） ethyl] chromone （1）， 6-methoxy-2- [2-（3-methoxy-4-hydroxyphenyl） ethyl] chromone （2）， 6，7-dimethoxy-2-（2-phenylethyl） chromone （3）， 6-hydroxy-2-（2-phenylethyl） chromone （4）， 6-hydroxy-2- [2-（4-methoxyphenyl） ethyl ] chromone（5）， 8-chloro-6-hydroxy-2- [2- （3-hydroxy-4-methoxyphenyl） ethyl]chromone （6）， 8-chloro-6-hydroxy-2- [2- （4-methoxyphenyl） ethyl] chromone （7）， oxidoagarochromone B （8）， 4′-demethoxyaqusisnenoned （9）. Compounds 6， 7 and 9 were isolated from agarwood of A. crassna for the first time. Among those， compounds 1 and 2 showed inhibitory activities against acetylcholinesterase. Compound 2 had weak inhibitory effect on K562 cell lines.

Key words：Cambodia， agarwood， Aquilaria crassna， chemical constituents， acetylcholinesterase inhibitory activity， cytotoxic activity

沉香為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）或擬沉香屬（Gyrinops）植物含有樹(shù)脂的干燥芯材（中國(guó)藥典委員會(huì)，2015）。沉香是傳統(tǒng)的名貴中藥和香料，其味辛、苦，性微溫，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘等功效，主要用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、胃虛氣逆喘急等（中國(guó)藥典委員會(huì)，2015）。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，沉香具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、細(xì)胞毒、抑菌、降糖、抗抑郁等藥理作用（戴好富，2017;楊洋等，2016;康科星等，2017）。目前報(bào)道的沉香屬植物約有23種，主要分布于中國(guó)、泰國(guó)、印度、緬甸、老撾、柬埔寨、馬來(lái)西亞、印度尼西亞等東南亞國(guó)家（戴好富和梅文莉，2015）。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)沉香的化學(xué)成分研究始于20世紀(jì)50年代，目前已鑒定出了300多個(gè)化學(xué)成分，主要是倍半萜類(lèi)和2-（2-苯乙基）色酮類(lèi)化合物（Chen et al.， 2012;戴好富，2017;Naef，2015;邵杭等，2015;Shao et al.， 2016;向盼等，2017;Xiang et al.， 2017）。

柯拉斯那沉香樹(shù)（A. crassna）主要分布于柬埔寨、泰國(guó)、老撾、越南等國(guó)家（戴好富和梅文莉，2015）。目前關(guān)于柯拉斯那沉香的化學(xué)成分和生物活性研究報(bào)道較少，本課題組前期對(duì)產(chǎn)自老撾的柯拉斯那沉香進(jìn)行了研究，報(bào)道了少量倍半萜類(lèi)和2-（2-苯乙基）色酮類(lèi)化合物，部分化合物具有一定的乙酰膽堿脂酶抑制活性和降血糖活性（康科星等，2017;王紅妮等，2016;楊洋等，2016;Yang et al.， 2017）。本研究選用柬埔寨野生柯拉斯那沉香為材料，從其乙醇提取物中分離鑒定了10個(gè)2-（2-苯乙基）色酮類(lèi)化合物（圖1），其中化合物6、7和9均為首次從柯拉斯那沉香中分離得到。初步揭示了柬埔寨柯拉斯那沉香的化學(xué)成分，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

沉香樣品于2017年11月購(gòu)于柬埔寨金邊，經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所王軍博士鑒定其基源植物為柯拉斯那（Aquilaria crassna），標(biāo)本編號(hào)為（JPZ20171101），保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器和試劑

儀器：柱層析硅膠G（200～300目，60～80目）（青島海洋化工廠）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó) Heidolph Laborota）;Sephadex LH-20（德國(guó)Merck公司）;ODS（20～45

SymbolmA@m）（日本 Fuji公司）;高效液相色譜儀（Agilent 1260）（美國(guó)安捷倫科技有限公司）;色譜柱（C18，250 mm×4.6 mm，ID）（日本 Nacalai Tesque公司）;Rudolph Autopol III polarimeter（美國(guó) Rudolph Research Analytical）;半制備高效液相色譜儀（SUMMIT P680A）（美國(guó)dionex公司）;半制備色譜柱（C18，250 mm×10.0 mm，ID）（日本 COSMOSIL公司）;ELX-800酶標(biāo)儀（美國(guó)寶特公司）;Bruker AV-500型超導(dǎo)核磁共振波譜儀，TMS為內(nèi)標(biāo)。

試劑：乙酰膽堿酯酶、碘化硫代乙酰膽堿、二硫代二硝基苯甲酸（DNTB）、他克林（美國(guó) Sigma 公司）;人慢性髓原白血病細(xì)胞株K562（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)）。

2 提取與分離

將干燥的柬埔寨柯拉斯那沉香樣品（928.0 g）用95% 乙醇加熱回流提取3次（每次3 h，每次加入乙醇5 L）減壓濃縮，得乙醇浸膏375.2 g。用水將乙醇提取物分散形成懸濁液，用石油醚進(jìn)行萃取，得到浸膏440.0 mg，剩余部分經(jīng)減壓柱色譜，以氯仿-甲醇（1∶0～0∶1）梯度洗脫，得到20個(gè)流份（Fr.1～Fr.20）。

Fr.9 （6.9 g） 經(jīng)Sephadex LH-20（石油醚∶氯仿∶甲醇 = 2∶1∶1）洗脫，得到3個(gè)流份（Fr.9-1～Fr.9-3）。Fr.9-3（5.0 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（50∶1）洗脫，得到9個(gè)流份（Fr.9-3-1～Fr.9-3-9）。Fr.9-3-6（306.5 mg）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-氯仿-丙酮（100∶10∶1）洗脫，得到14個(gè)流份（Fr.9-3-6-1～Fr.9-3-6-14）。Fr.9-3-6-14（41.0 mg）通過(guò)半制備高效液相色譜儀（C18柱，35%乙腈水，流速4 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)244 nm）洗脫，得到化合物 8（4.5 mg，保留時(shí)間12.8 min）。

Fr.12經(jīng)ODS柱色譜，以甲醇-水（3∶7～1∶0）梯度洗脫，得到12個(gè)流份（Fr.12-1～Fr.12-12）。Fr.12-7（1.5 g）析出部分白色固體，依次用石油醚、氯仿、丙酮、甲醇清洗得白色固體172.0 mg，再經(jīng)硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇（200∶1～0∶1）梯度洗脫，得到4個(gè)流份（Fr.12-7-1～Fr.12-7-4）。Fr.12-7-4（42.0 mg）通過(guò)半制備高效液相色譜儀（C18柱，65%甲醇水，流速4 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)222 nm）洗脫，得到化合物 6（5.9 mg，保留時(shí)間11.0 min）。Fr.12-7-2（29.4 mg）通過(guò)半制備高效液相色譜儀（C18柱，32%乙腈水，流速4 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm）洗脫，得到化合物5（4.0 mg，保留時(shí)間41.7 min）和化合物 4（4.4 mg，保留時(shí)間47.2 min）。Fr.12-10（1.9 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇為洗脫劑梯度洗脫，得到5個(gè)流份（Fr.12-10-1～Fr.12-10-5）。Fr.12-10-1（552.7 mg）經(jīng)ODS，以甲醇-水（3∶7～1∶0） 梯度洗脫，得到7個(gè)流份（Fr.12-10-1-1～Fr.12-10-1-7）。Fr.12-10-1-3（139.4 mg）通過(guò)半制備高效液相色譜儀（C18柱，32%乙腈水，流速4 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)222 nm）洗脫，得到4個(gè)流份（Fr.12-10-1-3-1～Fr.12-10-1-3-4）。Fr.12-10-1-3-3（19.0 mg）通過(guò)半制備高效液相色譜儀（C18柱，32%乙腈水，流速4 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)222 nm）洗脫，得到化合物 7（1.9 mg，保留時(shí)間21.2 min）。Fr.12-10-1-6（36.3 mg）通過(guò)半制備高效液相色譜儀（C18柱，45%乙腈水，流速4 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)244 nm）洗脫，得到化合物9（7.0 mg，保留時(shí)間12.8 min）。

石油醚萃取物（440.0 mg）經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇）得到3個(gè)流份（Fr.21～Fr.23）。Fr.22（321.2 mg）經(jīng)ODS（甲醇-水，3∶7～1∶0）梯度洗脫，得到6個(gè)流份（Fr.22-1～Fr.22-6）。Fr.22-5（90.8 mg）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮（80∶1）洗脫，得到4個(gè)流份（Fr.22-5-1～Fr.22-5-4）。Fr.22-5-4（20.0 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜儀（C18柱，60%甲醇水，流速4 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)198 nm）洗脫，得到化合物1（1.5 mg，保留時(shí)間11.5 min）和化合物 2（1.7 mg，保留時(shí)間13.3 min）。Fr.22-5-3（15.0 mg）通過(guò)半制備高效液相色譜儀（C18柱，58%甲醇水，流速4 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm）洗脫，得到化合物 3（1.1 mg，保留時(shí)間21.6 min）。

5 討論

迄今為止，關(guān)于柬埔寨所產(chǎn)沉香化學(xué)成分研究的文獻(xiàn)報(bào)道僅有一篇，且只得到了幾個(gè)簡(jiǎn)單的2-（2-苯乙基）色酮和倍半萜類(lèi)化合物（Alkhathlan & Al-Hazimi，2005）。本研究采用多種色譜技術(shù)，從柬埔寨柯拉斯那沉香乙醇提取物中分離得到10個(gè)2-（2-苯乙基）色酮類(lèi)化合物， 其中， 化合物6、7和9為首次從柯拉斯那沉香中分離得到，豐富了柬埔寨所產(chǎn)沉香的化學(xué)成分。目前，從沉香中分離鑒定出的含氯取代的2-（2-苯乙基）色酮和2-（2-苯乙基）色酮二聚體數(shù)量較少（Yagura et al.， 2003;Liao et al.， 2016;Gao et al.， 2012;Wu et al.， 2012;戴好富，2017;Huo et al.， 2018;Xiang et al.， 2017;Yang et al.， 2017）。本研究得到了兩個(gè)含氯取代的2-（2-苯乙基）色酮和兩個(gè)2-（2-苯乙基）色酮二聚體：8-氯-6-羥基-2- [2-（3-羥基-4-甲氧基苯）乙基]色酮（6）、8-氯-6-羥基-2- [2-（4-甲氧基苯）乙基]色酮（7）和4′-demethoxyaqusisnenoned（9），為研究不同產(chǎn)地沉香的化學(xué)成分差異提供了一定依據(jù)。本研究活性測(cè)試結(jié)果顯示，化合物1和2對(duì)乙酰膽堿脂酶具有一定的抑制活性，化合物2對(duì)人慢性髓原白血病細(xì)胞具有較弱的抑制活性，為柬埔寨柯拉斯那沉香的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

ADEKANMI AE， FOUCHE G， STEENKAMP V， 2012. Cytotoxicity and acetylcholinesterase inhibitory activity of an isolated crinine alkaloid from Boophanedisticha （Amaryllida-ceae） [J]. J Ethnopharmacol， 143（2）：572-578.

ALKHATHLAN HZ， AL-HAZIMI HM， 2005. Three 2-（2-phenylethyl）chromones and two terpenes from agarwood [J]. Nat Prod Res， 19（4）：367-372.

CHEN HQ， WEI JH， YANG JS， et al.， 2012. ChemInform abstract：Chemical constituents of agarwood originating from the endemic genus Aquilaria plants [J]. Chem Biodivers， 9（2）： 236-250.

DAI HF， 2017. Research progress of agarwood [M]. Beijing：Science Press：3-10.? [戴好富， 2017. 沉香的現(xiàn)代研究 [M]. 北京：科學(xué)出版社：3-10.]

DAI HF， MEI WL， 2015. Culture and artificial agarwood technology of aquilaria [M]. Beijing：China Agriculture Press：16-19.? [戴好富， 梅文莉， 2015. 沉香實(shí)用栽培和人工結(jié)香技術(shù) [M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社：16-19.]

ELLMAN GL， COURTNEY KD， JR AV， et al.， 1961. A new and rapid colorimetricdetermination of acetylcholinesterase activity [J]. Biochem Pharmacol， 7（2）：88-95.

GAO YH， LIU JM， LU HX， et al.， 2012. Two new 2-（2-phenylethyl）chromone-4-ones from Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg [J]. Helvet Chim Acta， 95（6）：951-954.

HUO HX， ZHU ZX， SONG YL， et al.， 2018. Anti-inflammatorydimeric 2-（2-phenylethyl） chromones from the resinous wood of Aquilaria sinensis [J]. J Nat Prod， 81（3）：543-553.

KANG KX，dAI HF， WANG P， et al.， 2017. Sesquiterpenoids of agarwood from Aquilaria crassna [J]. Chin Trad Herbdrugs， 48（22）：4601-4607.? [康科星， 戴好富， 王佩， 等， 2017. 柯拉斯那沉香的倍半萜類(lèi)化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥， 48（22）：4601-4607.]

KONISHI T， KONOSHIMA T， SHIMADA Y， et al.， 2002. Six new 2-（2-phenylethyl）chromones from agarwood [J]. Chem Pharm Bull， 50（3）：419-422.

LI W， 2014. Study on the chemical constituents and their bioactivities from Aquilaria sinensis and agarwood induced by artificial holing [D]. Haikou：Hainan University：39-54.? [李薇， 2014. 白木香與人工打洞沉香的化學(xué)成分與生物活性研究 [D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)：39-54.]

LIAO G， MEI WL，dONG WH， et al.， 2016. 2-（2-Phenylethyl）chromonederivatives in artificial agarwood from Aquilaria sinensis [J]. Fitoterapia， 110：38-43.

MEI WL， LIU J， LI XN， et al.， 2010. Study on the chemical constituents from Chinese eaglewood in Hainan [J]. J Trop Subtrop Bot， 18（5）：573-576.? [梅文莉， 劉俊， 李小娜， 等， 2010. 海南國(guó)產(chǎn)沉香的化學(xué)成分研究 [J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 18（5）：573-576.]

MOSMANN T， 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：Application to proliferation and cytoto-xicity assays [J]. J Immuno Methods， 65（1-2）：55-63.

NEAF R， 2015. The volatile and semi-volatile constituents of agarwood， the infected heartwood of Aquilaria species：A review? [J]. Flavour Fragrance J， 26（2）：73-87.

SHAO H， MEI WL， KONG FD， et al.， 2016. Fragrant sesqui-terpenes of agarwood from Gyrinops salicifolia [J]. Fitoterapia， 113：182-187.

SHAO H， MEI WL， LI W， et al.， 2015. Chemical constituents of agarwood originating from Gyrinops salicifolia [J]. Nat Prod Resdev， 27（12）：2046-2049.? [邵杭， 梅文莉， 李薇， 等， 2015. 柳葉擬沉香所產(chǎn)沉香的化學(xué)成分研究 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)， 27（12）：2046-2049.]

The State Pharmacopoeia Committee， 2015. Chinese Pharmacopoeia， Part 1 [S]. Beijing：Chemical Industry Press：185-186.? [中國(guó)藥典委員會(huì)， 2015. 中華人民共和國(guó)藥典2015版. 一部 [S]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社：185-186.]

WANG HN，dONG WH， MEI WL， et al.， 2016. Analysis on chemical constituents of Aquilaria crassna [J]. J Trop Biol， 7（1）：111-116.? [王紅妮， 董文化， 梅文莉， 等， 2016. 柯拉斯那沉香化學(xué)成分分析 [J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)， 7（1）：111-116.]

WU B， KWON SW， HWANG GS， et al.， 2012. Eight new 2-（2-phenylethyl）chromone （=2-（2-phenylethyl）-4H-1-benzopyran-4-one）derivatives from Aquilaria malaccensis agarwood [J]. Helv Chim Acta， 95（9）：1657-1665.

XIANG P， MEI WL， CHEN HQ， et al.， 2017. Four new bi-phenylethylchromones from artificial agarwood [J]. Fitoterapia， 120：61-66.

XIANG P， ZENG YB， MEI WL， et al.， 2017. Chemical constituents and bioactivities of Aquilariae Lignum Resinatum by artificial holing method [J]. J Chin Med Mat， 40（10）：2339-2343.? [向盼， 曾艷波， 梅文莉， 等， 2017. 人工打洞沉香的化學(xué)成分及生物活性研究 [J]. 中藥材， 40（10）：2339-2343.]

YANGdL， WANG H， GUO ZK， et al.， 2014. Fragrant agarofuran and eremophilane sesquiterpenes in agarwood‘Qi-Nan’ from Aquilaria sinensis [J]. Phytochem Lett， 8：121-125.

YANG JS， WANG YL， SU YL， et al.， 1989. Studies on the chemical constituents of Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg IV. Isolation and characterization of 2-（2-phenylethyl）chromonederivatives [J]. Acta Pharm Sin， 24（9）：678-683.? [楊峻山， 王玉蘭， 蘇亞倫， 等， 1989. 國(guó)產(chǎn)沉香化學(xué)成分研究 Ⅳ. 2-（2-苯乙基）色酮類(lèi)化合物的分離與鑒定 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 24（9）：678-683.]

YAGURA T， ITO M， KIUCHI F， et al.， 2003. Four new 2-（2-phenylethyl） chromonederivatives from withered wood of Aquilaria sinensis [J]. Chem Pharm Bull， 51（5）：560-564.

YANG Y， MEI WL，dONG WH， et al.， 2016. Bioactive components from agarwood originating from Aquilaria crassna [J]. J Trop Subtrop Bot， 24（5）：577-583.? [楊洋， 梅文莉， 董文化， 等， 2016. 柯拉斯那沉香的生物活性成分研究 [J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 24（5）：577-583.]

YANG Y， MEI WL， KONG FD， et al.， 2017. Four new bi-2-（2-phenylethyl）chromonederivatives of agarwood from Aquilaria crassna [J]. Fitoterapia， 119：20-25.