陳麗 邢琴 周忠志 劉沐琳 陳港軍 李利玲 李旺

〔摘要〕 目的 觀察中藥復(fù)方ANBP[由仙鶴草（Agrimonia Eupatoria， A）、 藕節(jié)（Nelumbo Nucifera Gaertn， N）、乳香（Boswellia Carteri， B） 和蒲黃（Pollen Typhae Angustifoliae， P）組成]對全層皮膚缺損小鼠創(chuàng)面愈合的影響，初步探討復(fù)方ANBP對小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的治療機制。方法 將48只C57BL/6小鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組、ANBP組，每組24只。采用全層打孔器制備小鼠背部全層皮膚缺損模型，每組再隨機分為6 h、3 d、7 d、14 d 4個時間點。造模后空白對照組不做任何處理，ANBP組創(chuàng)面被覆復(fù)方ANBP粉末。通過肉眼和HE染色觀察創(chuàng)面愈合情況并計算創(chuàng)面愈合率，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 （1）造模后3 d、7 d和14 d，與空白對照組相比，ANBP組創(chuàng)傷愈合率明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;（2）HE染色結(jié)果顯示ANBP組表皮舌長度增加、均勻平整，肉芽組織豐富。結(jié)論 復(fù)方ANBP可以明顯改善小鼠創(chuàng)面情況，加快小鼠背部皮膚創(chuàng)面愈合速度，提高愈合質(zhì)量。

〔關(guān)鍵詞〕 中藥復(fù)方;皮膚缺損;創(chuàng)面愈合;組織形態(tài)

〔中圖分類號〕R264? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.005

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of compound ANBP [（Agrimonia Eupatoria， A）， （Nelumbo Nucifera Gaertn， N）， （Boswellia Carteri， B） and （Pollen Typhae Angustifoliae， P）] on wound healing in mice with full-thickness skin defect， and preliminarily explore its related mechanism. Methods A total of 48 C57BL/6 mice were randomly divided into a blank control group and an ANBP group， with 24 mice in each group. And each group was also randomly divided into 4 time points of 6 h， 3 d， 7 d and 14 d to prepare the full-thickness skin defect model of mouse back by full-layer puncher. No treatment was given to the blank control group after modeling， and the wound was covered with compound ANBP powder in the ANBP group. The wound healing was observed by naked eye and HE staining and the wound healing rate was calculated. Also， the data were statistically analyzed. Results （1） Compared with the blank control group， the wound healing rate in the ANBP group was significantly increased after 3 d， 7 d and 14 d of the modeling， and the difference was statistically significant （P<0.05）; （2） HE staining showed that the length of epidermal tongue was increased， even and flat， with abundant granulation tissue. Conclusion Compound ANBP can significantly improve the wound condition in mice， accelerate the healing speed of the skin wound on the mouse back， and improve the healing quality.

〔Keywords〕 Chinese compound formula; full-thickness skin defect; wound healing; histomorphology

創(chuàng)傷和意外傷害是導(dǎo)致死亡、降低生活與工作質(zhì)量的重要原因。傷后創(chuàng)面經(jīng)常出現(xiàn)修復(fù)不足的慢性潰瘍現(xiàn)象，嚴重影響患者的生活和工作[1-3]。如何促進創(chuàng)面愈合成為皮膚損傷組織修復(fù)與再生的關(guān)鍵問題。目前，應(yīng)用多種細胞因子、干細胞作為種子細胞，修復(fù)受損皮膚，促進創(chuàng)面愈合，但難以有效用于臨床或臨床效果不佳[4-8]。

本課題組采用中藥復(fù)方ANBP微粉在臨床上治療皮膚組織創(chuàng)傷有一定的療效。ANBP由仙鶴草（Agrimonia Eupatoria，A）、 藕節(jié)（Nelumbo Nucifera Gaertn， N）、乳香（Boswellia Carteri，B）和蒲黃（Pollen Typhae Angustifoliae，P）4味經(jīng)典的治療創(chuàng)傷的中藥，按君臣佐使原則配伍構(gòu)成，具有止血止痛、消炎涼血、活血生肌的功效[9-10]，但具體機制尚不明確。本實驗是從形態(tài)學(xué)角度觀察復(fù)方ANBP對C57BL/6小鼠創(chuàng)面愈合的作用，探討其療效和作用機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1? 實驗動物

C57BL/6小鼠48只，鼠齡7周，雌性，SPF級，體質(zhì)量（20±2）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司;實驗操作過程中對動物的處置符合2009年《Ethical Issues in Animal Experimentation》中關(guān)于動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例。

1.2? 實驗藥物

復(fù)方ANBP，由仙鶴草、藕節(jié)、乳香和蒲黃4味中藥組成，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，藥物制備方法參考本課題組已發(fā)表論文[9]。

2 方法

2.1? 動物造模及分組

小鼠適應(yīng)環(huán)境3 d后，隨機分為2組：空白對照組24只、ANBP組24只。兩組小鼠再隨機分為4個時間點，每組6只。將實驗器械均消毒完畢后開始脫毛、備皮（選定創(chuàng)傷造模范圍及大小，在其背部使用彎剪進行基礎(chǔ)脫毛后，使用少量無刺激性脫毛膏脫毛2～3 min，最后用無菌棉簽將脫毛膏和殘存毛發(fā)處理干凈）、消毒（將脫毛后的皮膚區(qū)域依此使用碘酒及酒精），消毒完畢后用直徑1 cm的全層打孔器在小鼠背部制成全層皮膚缺損模型[11]。造模后，空白對照組不做處理，ANBP組的小鼠創(chuàng)面上立即均勻被覆上一層中藥復(fù)方ANBP粉末。

2.2? 標(biāo)本采集

造模后6 h、3 d、7 d、14 d，取空白對照組和ANBP組4個時間點造模的小鼠，用10%水合氯醛麻醉，對創(chuàng)面進行拍照記錄。取相同部位以創(chuàng)面為中心、深至骨組織的大小為2 cm×2 cm標(biāo)本（能確保修剪標(biāo)本時保留創(chuàng)傷后新生組織），于4%多聚甲醛的瓶中固定，常溫保存。

2.3? 小鼠創(chuàng)面肉眼觀察

觀察并記錄兩組小鼠不同時間點的愈合情況，測量各時間點的小鼠創(chuàng)面直徑，并利用Image Pro Plus計算出各時間點小鼠背部創(chuàng)面愈合面積。

創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-檢查時創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

2.4? 小鼠創(chuàng)面組織病理觀察

將固定在4%多聚甲醛中的標(biāo)本送至湖南中醫(yī)藥大學(xué)顯微形態(tài)實驗室，經(jīng)脫鈣液脫鈣（5%硝酸處理5～7 d），經(jīng)75%、85%、90%、95%乙醇及無水乙醇脫水，放入二甲苯透明，浸蠟包埋，切片機（廠家：LEICA;型號：RM2235）進行切片，37 ℃攤片，撈片，按順序裝籃，60 ℃的恒溫箱內(nèi)烤片，烤片2 h。脫蠟前放在70 ℃烤箱里加熱30 min，行HE染色。

2.5? 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以“x±s”表示，兩個樣本間比較方差齊性采用獨立樣本t檢驗，方差不齊則采用Mann-Whitney U秩和檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 小鼠創(chuàng)面愈合不同時間點的肉眼觀察

空白對照組：造模后6 h創(chuàng)緣內(nèi)翻、腫脹，創(chuàng)面濕潤、色澤偏亮、顏色偏淡，創(chuàng)緣交界處存在出血點;造模后3 d創(chuàng)緣凸起明顯，創(chuàng)面干燥、質(zhì)硬，痂皮較薄;造模后7 d可見大片較厚痂皮，質(zhì)硬，邊緣不規(guī)則;造模后14 d創(chuàng)緣出現(xiàn)新生毛發(fā)，創(chuàng)面仍未愈合，存在痂皮。ANBP組與空白對照組相比，造模后6 h創(chuàng)緣無明顯水腫、出血，創(chuàng)面干燥;造模后3 d可見創(chuàng)緣規(guī)則平整，創(chuàng)面色澤紅潤，質(zhì)軟，創(chuàng)面面積縮小;造模后7 d創(chuàng)緣可見新生表皮，創(chuàng)面與創(chuàng)緣平齊，創(chuàng)面面積進一步縮小;造模后14 d原創(chuàng)面完全愈合，皮膚平整，質(zhì)軟，周邊毛發(fā)生長良好（見圖1）。與空白對照組比較，ANBP組在造模后14 d的創(chuàng)面平均直徑的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

3.2? 復(fù)方ANBP對小鼠創(chuàng)面愈合率的影響

造模后3 d、7 d、14 d，與空白對照組相比，ANBP組小鼠創(chuàng)面面積縮小顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。具體見表2。

3.3? 小鼠背部創(chuàng)面不同時間點的組織病理學(xué)觀察

造模后6 h：空白對照組創(chuàng)緣皮膚各層水腫變性壞死明顯，深筋膜層結(jié)締組織水腫疏松，厚薄不一，少量炎細胞浸潤;創(chuàng)面深筋膜層層次紊亂不連續(xù)，未解離膨脹較薄，肌層肌細胞水腫變性壞死，肌纖維松解，肌膜內(nèi)有明顯充血;創(chuàng)緣表皮與深筋膜之間角度較大，見圖2A-2D。與空白對照組相比，ANBP組創(chuàng)緣皮膚各層水腫變性壞死程度輕微，深筋膜層無明顯水腫，厚薄均勻，炎細胞浸潤明顯;創(chuàng)面深筋膜層結(jié)構(gòu)完整連續(xù)，解離膨脹較厚，層次增多，血管擴張明顯;創(chuàng)緣的表皮與深筋膜之間角度明顯變小，見圖2E-2H。

造模后3 d：空白對照組創(chuàng)緣表皮層細胞數(shù)量增多，層次增厚，往創(chuàng)面增殖遷移，表皮舌厚薄不均，與創(chuàng)面垂直，創(chuàng)緣成纖維細胞和毛細血管少量增生，肉芽組織少，創(chuàng)緣痂塊松散易碎;創(chuàng)面大量炎性細胞浸潤，見圖3A、3B。與空白對照組相比，ANBP組創(chuàng)緣表皮舌厚度均一，與創(chuàng)面相平，長度更長，創(chuàng)緣成纖維細胞和毛細血管增生明顯，肉芽組織豐富，創(chuàng)緣痂塊緊密;創(chuàng)面膠原纖維增生明顯，見圖3C、3D。 造模后7 d：空白對照組創(chuàng)緣表皮層細胞大量增殖，尚未成熟，層次不清，厚薄不勻，表皮下有大量新生毛細血管，肉芽組織豐富，見圖4A、4B;與空白對照組相比，ANBP組創(chuàng)緣表皮層細胞成熟，層次清晰，厚薄較均一，出現(xiàn)新生毛囊，表皮下出現(xiàn)成纖維細胞和膠原纖維，毛細血管較少，真皮層結(jié)構(gòu)趨向成熟，見圖4C、4D。

造模后14 d：空白對照組創(chuàng)面已經(jīng)完全表皮化，部分新生的表皮層較厚，無毛囊、皮脂腺等附屬器，其下真皮成纖維細胞和膠原纖維致密，部分新生的表皮層較薄，其下真皮成纖維細胞和膠原纖維較致密，有大量未成熟的毛囊、皮脂腺等附屬器，未見皮膚肌層結(jié)構(gòu)，見圖5A-5D;與空白對照組相比，ANBP組創(chuàng)面新生的表皮層較成熟，厚度均一，其下真皮成纖維細胞和膠原纖維減少，組織疏松，有毛囊、皮脂腺、豎毛肌等附屬器，真皮層較成熟，可見皮下組織結(jié)構(gòu)，淺筋膜層血管豐富，可見皮膚肌層結(jié)構(gòu)，見圖5E-5G。

4 討論

創(chuàng)面修復(fù)的過程可以分為四個時期，即止血期、炎癥反應(yīng)期、增殖期、塑形期[12-16]。復(fù)方ANBP是本課題組臨床上治療創(chuàng)傷愈合的經(jīng)驗藥方。本實驗肉眼觀察顯示，ANBP組與空白對照組相比，造模后6 h減輕創(chuàng)緣水腫、出血，造模后3 d可見創(chuàng)緣規(guī)則平整，創(chuàng)面色澤紅潤，創(chuàng)面面積縮小，造模后7 d創(chuàng)緣可見新生表皮，創(chuàng)面與創(chuàng)緣平齊，創(chuàng)面面積進一步縮小，造模后14 d原創(chuàng)面完全愈合，皮膚平整，質(zhì)軟，周邊毛發(fā)生長良好。ANBP可以顯著提高在造模后3 d至14 d的愈合率，以上結(jié)果提示：復(fù)方ANBP可以加快小鼠創(chuàng)面愈合速度。

在創(chuàng)傷早期及時處理，迅速止血止痛，可以減少組織損傷，從而避免機體產(chǎn)生過強的防御反應(yīng)，在一定程度上減少炎癥反應(yīng)，有利于創(chuàng)傷快速愈合，及早完成一期愈合。本實驗組織病理學(xué)結(jié)果顯示，造模后6 h，空白對照組創(chuàng)緣組織明顯變性水腫壞死，而ANBP組創(chuàng)面干燥無明顯出血水腫變性壞死，說明復(fù)方ANBP在創(chuàng)傷早期可以迅速止血，減輕組織損傷;造模后3 d，空白對照組炎細胞浸潤明顯，而ANBP組出現(xiàn)豐富肉芽組織，表皮舌長度明顯增加，說明造模后3 d空白對照組仍處于炎癥反應(yīng)期，ANBP組已進入增殖期;造模后7 d，空白對照組表皮下有大量新生毛細血管，肉芽組織豐富，而ANBP組創(chuàng)緣表皮層及真皮層結(jié)構(gòu)比較成熟，層次清晰，出現(xiàn)新生毛囊，說明造模后7 d空白對照組仍處于增殖期，而ANBP組已進入塑形期;造模后14 d，空白對照組新生的表皮層厚薄不均，無毛囊、皮脂腺等附屬器，真皮成纖維細胞和膠原纖維致密，不成熟，而ANBP組創(chuàng)面新生的表皮層和真皮層較成熟，層次清晰，厚度均一，有毛囊、皮脂腺、豎毛肌等附屬器。以上結(jié)果說明，復(fù)方ANBP可以提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。

本實驗通過建立小鼠背部全層皮膚缺損模型，觀察創(chuàng)面愈合情況，運用復(fù)方ANBP達到減輕創(chuàng)傷早期損傷和炎癥反應(yīng)，加快肉芽組織增生和再表皮化速度，加速創(chuàng)傷愈合的進程，提高創(chuàng)傷愈合質(zhì)量。復(fù)方ANBP對小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的治療機制有待進一步驗證。

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