何峰 張雪蓮 溫祥臣

摘 要 目的：探討山楂酸對高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝（NAFLD）模型小鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響。方法：將72只C57BL/6小鼠隨機分為正常組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、辛伐他汀組（陽性對照，3 mg/kg）和山楂酸低、中、高劑量組（25、50、100 mg/kg），每組12只。正常組小鼠給予標準飼料喂養(yǎng)，其余各組小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)以誘導(dǎo)NAFLD模型。造模同時，各組小鼠灌胃相應(yīng)劑量的藥物，每天給藥1次，共計給藥12周。末次給藥后12 h，稱量各組小鼠體質(zhì)量及肝質(zhì)量，并計算肝指數(shù)；全自動生化分析儀測定其血清生化指標[天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）含量]變化；蘇木精-伊紅染色后觀察其肝組織病理形態(tài)變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測其肝組織中炎癥反應(yīng)指標[核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）含量]和分光光度法測定其中氧化應(yīng)激指標[丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性]變化。結(jié)果：與正常組比較，模型組小鼠肝指數(shù)顯著升高（P<0.05）；血清中HDL-C含量顯著降低，其余血清生化指標活性/含量均顯著升高（P<0.05）；肝小葉界限不清晰，肝組織發(fā)生明顯病理性改變；肝組織中炎癥反應(yīng)指標和MDA含量均顯著升高（P<0.05），SOD、GSH-Px活性顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，除山楂酸低劑量組小鼠肝組織中SOD活性升高和MDA含量降低不顯著外（P>0.05），其余各給藥組小鼠上述指標均顯著改善（P<0.05）；肝組織中球形脂滴及炎性細胞浸潤減少。結(jié)論：山楂酸可通過抗炎及抑制氧化應(yīng)激來減輕高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠的肝組織病變程度。

關(guān)鍵詞 山楂酸；炎癥反應(yīng)；氧化應(yīng)激；非酒精性脂肪肝；高脂飲食；小鼠

Effects of Crataegolic Acid on Inflammatory Response and Oxidative Stress in Non-alcoholic Fatty Liver Disease Model Mice Induced by High-fat Diet

HE Feng，ZHANG Xuelian，WEN Xiangchen（Dept. of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of crataegolic acid on inflammatory response and oxidative stress in non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） model mice induced by high-fat diet. METHODS： Totally 72 C57BL/6 mice were randomly divided into normal group （normal saline）， model group （normal saline）， simvastatin group （positive control， 3 mg/kg） and crataegolic acid low-dose， medium-dose and high-dose groups （25， 50 and 100 mg/kg）， with 12 mice in each group. Normal group was standard feed， while other groups were given high-fat diet to induce NAFLD model . At the same time of modeling， rats in each group was given relevant dose of drugs intragastrically， once a day， for consecutive 12 weeks. 12 h after last administration， body weight and liver weight of mice were determined， and liver index was calculated. The changes of serum biochemical indexes （activities of AST， ALT and contents of HDL-C， LDL-C， TG， TC） were determined by fully automatic biochemical analyzer. The pathological changes of liver tissue were observed after HE staining. The changes of inflammatory response indexes （contents of NF-κB， TNF-α， IL-6） in liver tissue were determined by ELISA， and the changes of oxidant stress indexes （contents of MDA， SOD and activity of GSH-Px） were determined by spectrophotometry. RESULTS： Compared with normal group， the liver index of mice in model group was increased significantly （P<0.05）. The serum content of HDL-C was decreased significantly， and the activities/contents of other serum biochemical indexes were increased significantly （P<0.05）. The boundary of hepatic lobules was not clear， and the liver tissue had obvious pathological changes. Inflammatory response indexes and the contents of MDA were increased significantly in liver tissue （P<0.05）， the activities of SOD and GSH-Px were decreased significantly （P<0.05）. Compared with model group， except that the increase of SOD activity and the decrease of MDA content of liver tissue were not significantly in crataegolic acid low-dose group （P>0.05）， while above indexes of mice in other administration groups were improved significantly （P<0.05）. The globular lipid droplets and inflammatory cell infiltration were decreased in liver tissue. CONCLUSIONS： Crataegolic acid can effectively alleviate the degree of liver lesions in NAFLD model mice induced by high-fat die through anti-inflammatory and inhibiting oxidative stress.

KEYWORDS Crataegolic acid； Inflammatory response； Oxidative stress； Non-alcoholic fatty liver disease； High-fat diet；mice

非酒精性脂肪肝（NAFLD）以肝臟過量脂肪沉積和肝細胞脂肪變性為主要特征，發(fā)病機制排除酒精和其他引起繼發(fā)性肝脂肪變性因素[1]。隨著人們飲食習(xí)慣的改變及生活水平的提高，肥胖、高血壓、高脂血癥、非胰島素依賴性糖尿病等疾病的發(fā)病人數(shù)相繼增多，使人群罹患NAFLD的風(fēng)險逐年增加，且NAFLD還會進一步促使心腦血管事件的發(fā)生[2]。NAFLD對社會發(fā)展和人類健康構(gòu)成了嚴重威脅，已成為新的重大健康問題。

山楂酸不僅存在于山楂的葉子和果實中，也存在于橄欖、大花紫薇、水楊梅、藿香、枇杷葉、石榴花等天然植物中，為一種五環(huán)三萜酸，具有抗炎、抗氧化、抗2型糖尿病、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性[3]。研究表明，山楂酸可以通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）通路以降低致炎因子的釋放，也可以通過增強清除氧自由基的能力，最終起到保護四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的作用[4]。然而到目前為止，山楂酸對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD的作用尚未見報道。同時，鑒于炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激在高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD的發(fā)生、發(fā)展環(huán)節(jié)中的重要作用[5-6]，本研究以高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠為研究對象，重點探討山楂酸對該模型小鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響，以期為山楂酸臨床治療高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD提供一種新的思路。

1 材料

1.1 儀器

Multiskan GO 1510型全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；EUR-04型高速組織勻漿器（美國Biospec公司）；AB104型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；CX5型全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）；L535R型冷凍離心機（湖南湘儀實驗儀器公司）；CM1900型冰凍切片機（德國Leica公司）；UV1900型雙光束紫外-可見分光光度計[讓奇（上海）儀器科技有限公司]。

1.2 藥品與試劑

山楂酸對照品（長沙雅瑩生物科技有限公司，批號：170324，純度：>90%）；辛伐他汀片（貴州天安藥業(yè)股份有限公司，批號：20170125，規(guī)格：10 mg/片）；NF-κB、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素6（IL-6）檢測試劑盒（北京同立海源生物科技公司，批號：20170426、20170513、20170622）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒（上海源葉生物公司，批號：171011、170908、171215）；蘇木精-伊紅（HE）染液（上海歌凡生物科技有限公司）。

1.3 動物

清潔級C57BL/6小鼠72只，♂，4周齡，購于北京維通利華公司，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2017- 0033。小鼠飼養(yǎng)條件為相對濕度50%、溫度23 ℃，按照國家實驗動物飼養(yǎng)標準飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、辛伐他汀組（陽性對照，3 mg/kg）和山楂酸低、中、高劑量組（25、50和100 mg/kg），每組12只。給藥劑量參考王穎等[4]的研究，并結(jié)合前期的預(yù)實驗結(jié)果而設(shè)置。正常組小鼠給予標準飼料喂養(yǎng)，其余5組小鼠給予高脂飼料（標準飼料中含0.5%膽酸、2%膽固醇和15%豬油）喂養(yǎng)；同時，各組小鼠灌胃相應(yīng)劑量的藥物，每天給藥1次，共計給藥12周。

2.2 體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)測定

末次給藥后12 h，稱量各組小鼠體質(zhì)量；摘眼球采血后，頸椎脫臼法處死小鼠，分離肝組織，精密稱質(zhì)量，計算肝指數(shù)[肝指數(shù)（%）=肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%]。

2.3 血清生化指標測定

取“2.2”項下小鼠血液，放于1.5 mL離心管中，離心（3 000 r/min、10 min），分離上清液，采用全自動生化分析儀檢測血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）含量。

2.4 肝組織病理形態(tài)觀察

取相同部位的小鼠肝組織，在10%甲醛溶液中浸泡24 h，先后經(jīng)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋等步驟，隨后在切片機上進行連續(xù)5 μm切片，烘干備用。常規(guī)方法進行HE染色，光鏡下觀察肝組織病理形態(tài)改變情況。

2.5 肝組織炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激指標測定

取相同部位的小鼠肝組織100 g，放入預(yù)冷至0 ℃的0.9 mL生理鹽水中，冰水浴下勻漿（3 000 r/min、5 min），得10%肝組織勻漿液。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定肝組織中炎癥反應(yīng)指標（NF-κB、TNF-α及IL-6含量），分光光度法測定肝組織中氧化應(yīng)激指標（SOD、GSH-Px活性及MDA含量），相關(guān)操作嚴格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作指南進行。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用Shapiro-Wilk法檢驗正態(tài)性，Levene法檢驗方差齊性；符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 山楂酸對模型小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)的影響

與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝指數(shù)均明顯升高（P<0.05），提示模型建立成功；與模型組比較，山楂酸各劑量組及辛伐他汀組小鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而肝質(zhì)量和肝指數(shù)均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)測定結(jié)果見表1。

3.2 山楂酸對模型小鼠血清中AST和ALT活性的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清中AST、ALT活性顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，山楂酸各劑量組及辛伐他汀組小鼠血清中AST、ALT活性均顯著降低（P<0.05）。各組型小鼠血清中AST和ALT活性測定結(jié)果見表2。

3.3 山楂酸對模型小鼠血清中HDL-C、LDL-C、TG和TC含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清中HDL-C含量顯著降低（P<0.05），而LDL-C、TG和TC含量均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，山楂酸各劑量組及辛伐他汀組小鼠血清中HDL-C含量均顯著升高（P<0.05），而LDL-C、TG和TC含量均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠血清中HDL-C、LDL-C、TG和TC含量測定結(jié)果見表3。

3.4 山楂酸對模型小鼠肝組織病理形態(tài)的影響

正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝組織結(jié)構(gòu)正常，周圍細胞索呈放射狀排列，無脂肪變性細胞，細胞質(zhì)均勻；模型組小鼠肝小葉界限不清晰，肝組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，出現(xiàn)大量球形脂滴，炎癥細胞浸潤；與模型組比較，山楂酸各劑量組及辛伐他汀組小鼠肝組織病理形態(tài)得到一定程度改善，球形脂滴及炎癥細胞浸潤減少，其中尤以山楂酸高劑量組及辛伐他汀組小鼠改善更為明顯。各組小鼠肝組織病理觀察結(jié)果見圖1。

3.6 山楂酸對模型小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性顯著減低（P<0.05），MDA含量顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，山楂酸中、高劑量組和辛伐他汀組小鼠肝組織中SOD活性及山楂酸各劑量組、辛伐他汀組小鼠肝組織中GSH-Px活性均顯著升高（P<0.05），山楂酸中、高劑量組和辛伐他汀組小鼠肝組織中MDA含量均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性及MDA含量測定結(jié)果見表5。

4 討論

脂肪代謝主要發(fā)生在肝臟，長期大量的高脂飲食會增加肝對脂肪的攝取，當肝臟中的脂肪攝取速度大于排出時，會導(dǎo)致肝脂肪變性。高脂飲食飼養(yǎng)誘導(dǎo)的動物模型可以較好地模擬人類NAFLD的發(fā)生、發(fā)展過程，且具有胰島素抵抗、肥胖等特征，應(yīng)用廣泛[7]。辛伐他汀可以抑制內(nèi)源性膽固醇合成，為羥甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是臨床上治療高脂血癥的常用藥物，在NAFLD相關(guān)研究中也經(jīng)常作為陽性藥使用[8]。在本研究中，高脂飲食飼養(yǎng)小鼠12周后，模型組小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝指數(shù)均明顯升高，肝組織出現(xiàn)大量的脂滴，并出現(xiàn)炎性細胞浸潤，提示建模成功。而山楂酸各劑量組小鼠肝質(zhì)量及肝指數(shù)均顯著下降，且肝組織病理形態(tài)得到一定程度改善，表明山楂酸具有保護高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝臟病變的作用。血清中AST、ALT活性及HDLC、LDLC、TG、TC含量是反映NAFLD最常用的指標[9]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，山楂酸可以降低模型小鼠血清中AST、ALT活性及L-DLC、TG、TC含量，升高H-DLC含量，此結(jié)果進一步證實了山楂酸對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠肝病變的保護作用。

炎癥反應(yīng)在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而NF-κB、TNF-α及IL-6與炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)[10]。NF-κB、TNF-α及IL-6等炎癥細胞因子能促進肝細胞脂肪變性、外周脂肪分解、壞死、凋亡及炎癥，最終導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生[11]。NF-κB可以被食物中的游離脂肪酸（FFA）激活，進而促進TNF-α、IL-6等炎癥細胞因子表達的增加，引起脂肪性肝損傷。一項關(guān)于護肝清脂片緩解NAFLD的機制的研究表明，抑制NF-κB活性進而減輕肝細胞炎癥反應(yīng)是其緩解NAFLD進程的機制之一[12]。唐彬等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝大鼠肝組織炎癥損傷和肝細胞變性有較好的改善作用，其機制與TNF-α及IL-6等炎癥因子的表達被抑制有關(guān)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝組織中NF-κB、TNF-α及IL-6含量明顯升高，而山楂酸各劑量組小鼠肝組織中NF-κB、TNF-α及IL-6含量顯著降低，此結(jié)果提示山楂酸可以有效抑制高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝組織的炎癥反應(yīng)。

氧化應(yīng)激是指機體內(nèi)活性氧簇（ROS）產(chǎn)生速度加快，超出清除能力，進而導(dǎo)致組織損傷，是NAFL的發(fā)病機制之一[14]。肝既是ROS產(chǎn)生的主要場所，也是ROS攻擊的主要靶器官。SOD能夠避免體內(nèi)ROS濃度過高時引起的不良反應(yīng)，是一種重要的ROS清除劑，可以使機體內(nèi)的ROS處于平衡狀態(tài)。在NAFLD模型中，SOD活性明顯降低，使ROS累積增多，最終加重肝細胞損傷[15]。GSH-Px在人體各組織中均存在，其中以肝組織中GSH-Px的活性最高，是內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，具有清除ROS及防止肝氧化應(yīng)激損傷的作用。一項關(guān)于糖肝康對NAFLD模型大鼠肝損傷的保護作用的研究表明，其能夠通過提高GSH-Px的活性，發(fā)揮對NAFLD模型大鼠肝臟損傷的保護作用[16]。MDA半壽期較ROS長，是一種強毒力的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，能擴散到細胞內(nèi)、外其他靶位，進而加重氧化應(yīng)激的損害范圍。研究表明，NAFLD患者MDA含量明顯增高，并且與肝組織脂化、纖維化、炎癥及壞死程度正相關(guān)[17]。SOD、GSH-Px活性及MDA含量，三者通?；ハ嗯浜戏从硻C體發(fā)生氧化損傷的程度[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性顯著降低，而MDA含量顯著升高，表明模型小鼠肝組織存在氧化損傷；而山楂酸各劑量組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性均顯著升高，MDA含量均顯著降低，這提示山楂酸可以有效抑制高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠肝組織氧化應(yīng)激水平。

綜上所述，山楂酸可通過抗炎及抑制氧化應(yīng)激水平，有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠的肝病變程度，但具體的分子機制還有待深入研究。

參考文獻

[ 1 ] ZHOU Y，ZHENG T，CHEN H，et al. Microbial intervention as a novel target in treatment of non-alcoholic fatty liver disease progression[J]. Cell Physiol Biochem，2018，51（5）：2123-2135.

[ 2 ] ALBHAISI S，ISSA D，ALKHOURI N. Non-alcoholic fatty liver disease：a pandemic disease with multisystem burden[J]. Hepatobiliary Surg Nutr，2018，7（5）：389-391.

[ 3 ] 刁琢，馮旭，儲智勇，等.山楂酸的藥理作用及結(jié)構(gòu)修飾研究進展[J].中國食品添加劑，2016，21（8）：210-218.

[ 4 ] 王穎，蔡永青，黃明春，等.山楂酸對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用及機制研究[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2016，21（8）：854-858.

[ 5 ] JAVADI L，KHOSHBATEN M，SAFAIYAN A，et al. Pro- and prebiotic effects on oxidative stress and inflammatory markers in non-alcoholic fatty liver disease[J]. Asia Pac J Clin Nutr，2018，27（5）：1031-1039.

[ 6 ] FUJII J，HOMMA T，KOBAYASHI S，et al. Mutual interaction between oxidative stress and endoplasmic reticulum stress in the pathogenesis of diseases specifically focusing on non-alcoholic fatty liver disease[J]. World J Biol Chem，2018，9（1）：1-15.

[ 7 ] FU D，CUI H，ZHANG Y. Lack of ClC-2 alleviates high fat diet-induced insulin resistance and non-alcoholic fatty liver disease[J]. Cell Physiol Biochem，2018，45（6）：2187-2198.

[ 8 ] 符恒.辛伐他汀治療非酒精性脂肪性肝炎的療效觀察[J].內(nèi)科，2014，9（6）：677-678.

[ 9 ] 譚丹楓，陶月英，姜媛，等.膽石六號顆粒對模型小鼠非酒精性脂肪肝的改善作用研究[J].中國藥房，2018，29（22）：3106-3110.

[10] LEI L，ZHOU C，YANG X，et al. Down-regulation of microRNA-375 regulates adipokines and inhibits inflammatory cytokines by targeting AdipoR2 in non-alcoholic fatty liver disease[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol，2018，45（8）：819-831.

[11] ASSUN??O SNF，SORTE NCAB，ALVES CAD，et al. Inflammatory cytokines and non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） in obese children and adolescents[J]. Nutr Hosp，2018，35（1）：78-83.

[12] 姚笑睿，夏凡，唐外姣，等.護肝清脂片對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟中AMPK通路激活及NF-κB-p65蛋白的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017，37（1）：56-62.

[13] 唐彬，宋振梅，肖琦凡.黃芩苷對高脂-脂肪肝模型大鼠肝臟炎癥改善及炎性因子表達的影響[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2017，53（6）：659-663，667.

[14] ZHU CG，LIU YX，WANG H，et al. Active form of vitamin D ameliorates non-alcoholic fatty liver disease by alleviating oxidative stress in a high-fat diet rat model[J]. Endocr J，2017，64（7）：663-673.

[15] EBRAHIMI-MAMEGHANI M，JAMALI H，MAHDAVI R，et al. Conjugated linoleic acid improves glycemic response，lipid profile，and oxidative stress in obese patients with non-alcoholic fatty liver disease： a randomized controlled clinical trial[J]. Croat Med J，2016，57（4）：331- 342.

[16] 錢秋海，錢衛(wèi)斌，蔡欣蕊，等.糖肝康對糖尿病非酒精性脂肪肝模型大鼠血清GSH、GSH-Px表達的影響[J].中醫(yī)學(xué)報，2016，31（4）：499-501，505.

[17] SUNDARAM SS，HALBOWER A，PAN Z，et al. Nocturnal hypoxia-induced oxidative stress promotes progression of pediatric non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Hepatol，2016，65（3）：560-569.

[18] K?RO?LU E，CANBAKAN B，ATAY K，et al. Role of oxidative stress and insulin resistance in disease severity of non-alcoholic fatty liver disease[J]. Turk J Gastroenterol，2016，27（4）：361-366.

（收稿日期：2018-12-14 修回日期：2019-01-12）

（編輯：林 靜）