胡曉甜 劉守贊 白巖 徐琳煜 丁恒 吳學謙 許海順 鄭炳松

摘 要： 為探究抗癌藥物浙江三葉青在不同遮陰處理下其有效成分總黃酮含量及生理生化響應(yīng)，該研究設(shè)置5個光照梯度（全光照CK、遮陰30%、50%、70%、90%），以三葉青二年生扦插苗為材料，處理6個月后，測定三葉青在不同遮陰梯度條件下的生長指標、生化指標以及不同部位（葉片和塊根）的總黃酮含量。結(jié)果表明：遮陰70%的處理中植株長勢最佳，隨著光照強度的減弱，三葉青生物量呈現(xiàn)先增高后降低趨勢;比葉重呈降低趨勢;葉片中的可溶性蛋白（SP）、游離脯氨酸（FP）和超氧化物歧化酶（SOD）含量均在全光照下最高，遮陰70%時最低，分別比全光照降低了33.36%、17.22%、46.88%，表現(xiàn)出光脅迫特點;總黃酮含量為葉片>塊根，且均以遮陰70%下含量最高，從整體來看，總黃酮含量隨著遮陰度的增大而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。這表明光照強度是影響浙江三葉青生長及有效成分積累的重要因素，且高光強在一定程度上抑制三葉青植株的生長，適當遮陰對三葉青植株的生長起促進作用，但塊根和葉片中的總黃酮含量對光強的響應(yīng)卻不同，這為今后科學栽培種植及合理有效開發(fā)三葉青提供了科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 三葉青， 遮陰處理， 生長特性， 生理指標， 總黃酮含量

中圖分類號： R28 ?文獻標識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2019）07-0925-08

Abstract： Tetrastigma hemsleyanum is a kind of medicinal herbs， in which total flavonoids have anti-cancer effects. In recent years， with the increasing medical demand， it is imperative to explore the economic and biomimetic cultivation under the trees. The purpose of this study was to investigate total flavonoids contents， physiological and biochemical characteristics of T. hemsleyanum in Zhejiang Province responsed to different light intensities. Biennial cuttings were used as experimental materials and five light gradients （full light， shade 30%， 50%， 70% and 90%） were set up. After six months’ treatment， we determined the growth parameters （growth， biomass）， biochemical parameters ＼[soluble protein （SP）， free proline （FP）， superoxide dismutase （SOD）＼] and contents of total flavonoids in different parts （leaves and rhizomes）. The results showed that total length of the stems， maximum length and width of leaves， weight of single rhizomes increased first and then decreased with the decrease of light intensity; specific leaf weights decreased overall. Contents of SP， FP and SOD in leaves were the highest with full light conditions， the lowest with 70% shading （lower than total light was 33.36%， 17.22%， 46.88%）. It showed that excessive high light and low light both affected photosynthesis and accumulation of active ingredients. Total flavonoid contents in leaves were higher than those in rhizomes， and the highest values of leaves （6.16 mg·g-1） and rhizomes （2.21 mg·g-1） were treated with 70% shading. In general， T. hemsleyanum grew best and suffered lowest stress in 70% shading treatments. The study indicates that light intensity is an important factor affecting the growth and accumulation of active constituents in T. hemsleyanum of Zhejiang Province， and high light intensity inhibits the growth of T. hemsleyanum to a certain extent， and appropriate shading promotes the growth. The total flavonoid content in the leaves responded differently to light intensity， which provided a scientific reference for scientific cultivation and rational development of T. hemsleyanum in the future.

Key words： Tetrastigma hemsleyanum， shade treatment， growth characteristics， physiological indicators， total flavonoids

三葉青（Tetrastigma hemsleyanum）是葡萄科三葉崖爬藤屬（Tetrastigma Vitaceae）植物，以塊根或者全草入藥。藥理研究表明，三葉青無毒無害，具有抗腫瘤、保肝、抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用（陳麗蕓和郭素華，2012）。其中，三葉青中的黃酮類有效成分對肝癌、食管癌和結(jié)腸癌細胞皮下移植瘤等多種腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移凋亡均有明顯的抑制作用（汪正飛等，2017;鐘良瑞等，2016;林霜等，2016;張勝強等，2017），藥用價值極高。因此，研究促進三葉青中黃酮類化合物合成的條件極其必要。

野生三葉青生于山坡、山溝或溪谷兩旁林下陰處，強光照射常導(dǎo)致生長發(fā)育不良，甚至死亡，因此，引發(fā)學者對光調(diào)控三葉青生理特性及總黃酮積累的研究興趣。徐琳煜等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，強光、高溫、低濕等環(huán)境條件使三葉青光合活躍度下降，對其生長產(chǎn)生脅迫;并且三葉青的氣孔導(dǎo)度、蒸騰作用和葉綠素熒光響應(yīng)等均受到光照強度的影響（Dai et al.， 2009;劉崟艷等，2015）;彭昕等（2012）以不同光照周期處理三葉青，結(jié)果顯示，連續(xù)光照有利于三葉青愈傷組織中黃酮類物質(zhì)的積累，黑暗抑制黃酮化合物的合成。目前，光調(diào)控三葉青黃酮化合物合成積累、生理生化過程、生長發(fā)育的研究還較為基礎(chǔ)，其植株和塊根生長、可溶性物質(zhì)及有效成分在光調(diào)控下的變化規(guī)律尚未見報道。因此，本研究以浙江省三葉青的生長特性、可溶性蛋白（SP）、游離脯氨酸（FP）、超氧化物歧化酶（SOD）和總黃酮含量為主要指標，探究其對光照強度的響應(yīng)規(guī)律，研究結(jié)果可為三葉青進一步研究提供科學依據(jù)，具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 研究地概況和材料處理

選用2 a生小葉型高產(chǎn)三葉青品系扦插苗為試驗材料，由浙江省臺州市黃巖常柳植物科技有限公司提供，經(jīng)浙江農(nóng)林大學周愛存博士鑒定為三葉青。試驗于浙江農(nóng)林大學省部共建重點實驗室進行（119°43′26.92″ E， 30°15′30.39″ N）。

2016年3月末，將三葉青扦插苗移栽至營養(yǎng)缽中，基質(zhì)用田園土、泥炭、珍珠巖、牛糞按照4∶4∶4∶1配比制成。放在遮陰棚下緩苗1個月后，選取長勢一致、健壯、無病蟲害的三葉青苗60盆，隨機分為3個重復(fù)，每個重復(fù)中分為5組，每組4盆，分別放置在遮陰度為30%（光強約為550 μmol·m2·s-1）、50%（光強約390 μmol·m2·s-1）、70%（光強約235 μmol·m2·s-1）和90%（光強約80 μmol·m2·s-1）的遮陰棚里，對照組（CK）用白色雙透網(wǎng)遮蓋。所有遮陰棚內(nèi)光強均采用照度計測定透光率，選擇晴朗無云的正午（光強約780 μmol·m2·s-1 ）連續(xù)測定一周，將透光率誤差控制在±5%左右。

定期對各處理的三葉青苗進行澆水、殺蟲、除草、生長搭架等日常養(yǎng)護工作。生長指標、生理指標、總黃酮含量選擇處理6個月后進行測定。

1.2 儀器和試劑

紫外分光光度計（UNICO 3802 UV/VIS Spectrophotometer）、超聲儀（KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器）、蘆丁標準品（天津萬象恒遠科技有限公司，序列號為PCM-MA-005，純度≥97 %）、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250試劑、茚三酮。

1.3 生理生化指標測定

1.3.1 生長量及生物量 每種光強處理選擇長勢相近的三葉青3株，測定莖長（cm）、最大葉片長和葉寬（cm）、植株鮮重（g）、干重（g）、塊根單株產(chǎn)量（g），比葉重采用打孔法測定并計算，重復(fù)3次。

1.3.2 生化指標 可溶性蛋白（SP）采用考馬斯亮藍G-250方法測定，游離脯氨酸（FP）含量采用茚三酮顯色法測定，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）法測定（李合生，2000）。

1.4 總黃酮含量測定

1.4.1標準品制備 參照張朝輝和丁芳林（2016）超聲提取法制備總黃酮標準品。

1.4.2 供試樣品制備 參照張朝輝和丁芳林（2016）超聲提取法制備總黃酮供試品。

1.4.3 方法學考察 （1）線性關(guān)系考察：分別吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL標準品溶液于25 mL 容量瓶中，按照1.4.2方法制備樣品。在510 nm波長下測定吸光度，繪制標準曲線。（2）穩(wěn)定性考察：按1.4.2方法制備供試品，分別在0、15、30、45、60、75 min測定其吸光值，計算RSD值。（3）重復(fù)性考察：按1.4.2方法重復(fù)制備5份供試品，分別測定其吸收度，計算RSD值。（4）精密度考察：按1.4.1方法制備標準品，吸取5次，測定其吸收度，計算RSD值。

1.4.4 樣品含量測定 每個光強處理取樣品3株，按1.4.2方法制備供試品，測定其吸收度，帶入回歸方程計算總黃酮的濃度及含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光強處理對三葉青生長性狀的影響

遮陰處理后，三葉青生長狀況如圖1所示。隨著遮陰程度升高至70%，葉片顏色逐漸加深，植株長勢良好，塊根數(shù)量較多，遮陰達到90%時，葉片顏色變淡，植株生長矮小，塊根長勢不佳，表明高光強和過度遮陰均不利于三葉青的植株生長和塊根結(jié)塊。

三葉青生長量結(jié)果如表1所示。隨著光照強度的逐漸減弱，莖長、最大葉片長、最大葉片寬及塊根單株產(chǎn)量均呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，且均在70%遮陰處理下達到最大值，表明適當?shù)恼陉幙梢源龠M三葉青植株生長及塊根產(chǎn)量。徐大鵬等（2013）研究發(fā)現(xiàn)隨著光照強度的降低，胡麻（Linum usitatissimum ）的株高和節(jié)間距呈上升趨勢;很弱的光照強度使胡麻的幼莖變細，硬度降低，無法發(fā)育成苗。在弱光條件下，植物為更好地獲取光能進行光合生長，葉片面積會變大，與劉林等（2017）的研究結(jié)果相同。

圖2結(jié)果顯示，三葉青葉片鮮、干重隨著光照強度的減弱，呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，且均在遮陰70%處理中達到最大值，顯著高于其他處理。計算得出，葉片干鮮比隨光照強度的減弱呈下降趨勢（分別為0.36、0.26、0.24、0.25、0.22），結(jié)合表1得出，遮陰促進植物葉片形態(tài)建成，但是其干物質(zhì)合成效率有所降低。

圖3結(jié)果顯示，比葉重在遮陰90%處理中達到最小值， 其他各處理隨著光照強度的降低而呈現(xiàn)降低趨勢，但差異不顯著。分析認為，過低的光照強度抑制植物光合作用，干物質(zhì)積累不足，最終影響植株正常生長發(fā)育（李婷等，2016）。

2.2 不同光強對三葉青相關(guān)生化指標的影響

圖4為SP、FP、SOD含量的測定結(jié)果。由圖4可知，與全光照和遮陰90%處理相比，SP、FP、SOD含量均以遮陰70%處理下達到最小值，分別比全光照分別降低了33.36%、17.22%、46.88%，且差異顯著;遮陰30%和50%處理下的SP、FP、SOD含量略高于70%處理。分析認為，三葉青對遮陰30%～70%之間的光照強度較為適應(yīng)，而全光照和遮陰90%則使其處于光逆境中，3個指標含量顯著增加，產(chǎn)生明顯的抗逆反應(yīng)（何靜雯等，2018）。

2.3 總黃酮含量測定結(jié)果

2.3.1 方法學考察結(jié)果 蘆丁標準品線性關(guān)系方程為A=11.000 C+0.002，R2=0.999。其中，A為吸收度，C為標準品濃度。穩(wěn)定性試驗結(jié)果良好，即三葉青塊根和葉片中總黃酮提取物在75 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.37%;重復(fù)性考察結(jié)果RSD為3.33%，表明該試驗重復(fù)性較好;精密度試驗結(jié)果RSD為0.78%，顯示精密度良好。

2.3.2 樣品含量測定結(jié)果 三葉青葉片和塊根中總黃酮含量測定結(jié)果見圖5。

由圖5可知，三葉青葉片中的總黃酮含量高于塊根含量，且二者變化趨勢均為隨著光照強度的減小呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中，葉片總黃酮含量以遮陰70%處理下的最高，為6.16 mg·g-1，與90%處理差異顯著;塊根中的總黃酮含量亦為70%處理下最高，為2.21 mg·g-1，與遮陰30%和50%相近，顯著高于CK和90%處理，說明適當遮陰會促進總黃酮的積累。羅寶麗等（2011）研究表明紫金牛（Ardisia japonica）根、莖、葉間總黃酮含量的高低順序大致為葉>根>莖;不同的光照強度對2年生銀杏（Ginkgo biloba）的不同部位的總黃酮含量及其產(chǎn)量均有影響，其中銀杏的總黃酮含量及產(chǎn)量以76%光照處理最高（Xu et al.， 2014）。

3 討論與結(jié)論

3.1 三葉青生長特性對不同光強的響應(yīng)

在不同遮陰處理下，三葉青的生長特性呈規(guī)律性變化，即隨著光照強度的減弱，莖長、最大葉片長、葉寬、塊根單株量及鮮干重呈現(xiàn)先增高后降低趨勢，比葉重呈降低趨勢，且均在遮陰70%處理下達到最大值。蔡虎銘等（2018）研究發(fā)現(xiàn)不同光強對滇重樓（Paris polyphylla var. yunannensis）生物量的積累有顯著影響;不同光強對櫻桃蘿卜（cherry radish）的干、鮮重有一定差異（查凌雁和劉文科，2018），與本研究結(jié)果相同;王銳潔等（2019）研究發(fā)現(xiàn)遮陰可增加虎耳草的葉寬、葉長、總?cè)~面積和降低葉厚;劉林等（2017）發(fā)現(xiàn)很多植物在弱光條件下通過降低比葉重來增加受光面積;Dai et al.（2009）的研究表明當植物生長在67%遮陰梯度下時，三葉青葉片外觀最好，Pn值最大;當光強度超過50%時，由于光抑制，光合作用下降。

三葉青葉片干鮮比隨著光照強度的減弱呈現(xiàn)直線下降的規(guī)律，說明遮陰處理會降低三葉青干物質(zhì)的合成和積累效率，總體來說，光強對植株鮮重影響較大，對干重影響不顯著，與查凌雁和劉文科（2018）研究結(jié)果相似。

3.2 不同光強對三葉青生化指標的影響

隨著光照強度的減弱，三葉青葉片中的SP、FP、SOD的含量均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在70%遮陰處理下達到最小值，遮陰90%處理下出現(xiàn)微上升，表現(xiàn)出對強光及弱光脅迫的響應(yīng)。多種植物研究表明，逆境條件下，SP、FP與SOD會大量積累，故而常作為抗逆性指標（何靜雯等，2018），例如，陶巧靜等（2014）發(fā)現(xiàn)西洋杜鵑（Rhododendron hybridum）在光強脅迫下通過提高SP含量來幫助維持植物細胞較低的滲透勢，從而抵抗脅迫帶來的傷害;陳磊等（2012）研究表明，茄子（Solanum melongena ）在遮陰條件下會通過FP的積累來增強自身滲透調(diào)節(jié)能力，適應(yīng)弱光脅迫;榿木幼苗在遭受脅迫時，其體內(nèi)超氧離子基團會增加，SOD含量上升（劉柿良等，2012），以上結(jié)果均與本研究結(jié)果相近，即三葉青在全光照和遮陰90 %時SP、FP、SOD含量較高，應(yīng)是對光環(huán)境的一種自我適應(yīng)機制。

3.3 不同光照處理下三葉青葉片及塊根中總黃酮含量的比較

三葉青塊根和葉片中的總黃酮含量均受光強變化調(diào)控，以遮陰70%時含量最高，且總黃酮含量為葉片>塊根。研究顯示，適宜的光照強度能夠影響植物黃酮化合物的合成，例如，蘇文華等（2006）發(fā)現(xiàn)光強會影響燈盞花（Erigeron breviscapus）的生長與總黃酮含量，在全光照下其生物量積累和黃酮產(chǎn)量最高;銀杏葉中黃酮類化合物存在顯著的光強效應(yīng)（徐友等，2016）。此外，光強也可以影響不同藥用部位的總黃酮含量，如野薔薇（Rosa multiflora）中總黃酮含量為根皮>葉>莖>青果皮>紅果皮>紅果籽>青果籽（王玲等，2015）。

綜上所述，浙江省三葉青在遮陰70%處理下葉色深綠、長勢最佳、生物量最大，且塊根和葉片中總黃酮含量最高;高光強在一定程度上抑制三葉青的生長和有效成分合成積累，適當遮陰對植株的生長起促進作用。由于本試驗是以浙江三葉青作為主要材料進行遮光處理并研究，故所得結(jié)果存在一定的局限性，但仍可為進一步研究三葉青對光調(diào)控響應(yīng)機制提供科學依據(jù)。

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