趙展平 何芳 唐軍榮 羅旭璐 趙平 黃薦 丁勇

摘 要： 為解決樟葉越桔（Vaccinium dunalianum）組培苗生根質量不佳、移栽成活率低的問題，該研究以樟葉越桔繼代苗為材料，采用單因子試驗從激素類型及濃度、培養(yǎng)基類型和蔗糖質量濃度對其生根的適宜條件進行篩選，進一步研究了不同基質配比對樟葉越桔移栽苗存活率的影響。結果表明：激素類型和濃度、培養(yǎng)基類型對樟葉越桔生根率的影響最大，其次為蔗糖質量濃度;最適合樟葉越桔生根的激素及濃度為IBA 2.0 mg·L-1、基本培養(yǎng)基類型為1/4MS、蔗糖質量濃度為15 g·L-1，樟葉越桔組培苗最佳生根培養(yǎng)基為1/4MS + IBA 2.0 mg·L-1 + 活性炭0.1 g·L-1 + 蔗糖15 g·L-1，生根率達100%，平均生根數(shù)為每株7.67條;根系呈輻射狀、基部無愈傷組織，組培苗生長健壯、葉色濃綠;樟葉越桔組培苗移栽時以全腐殖土基質為佳，成活率為83.7%，植株葉片舒展，生長狀況良好。該研究建立的優(yōu)化體系有效地提高了樟葉越桔組培生根苗的生根率和生根質量，解決了后期移栽成活困難的問題，為優(yōu)良的樟葉越桔植株規(guī)?；a提供了科學依據(jù)和技術支持。

關鍵詞： 樟葉越桔， 激素， 生根， 移栽， 組培苗

中圖分類號： Q943.1 ?文獻標識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2019）07-0967-09

Abstract： Vaccinium dunalianum is one of the main plant sources for arbutin which is widely used in cosmetic formulations as the natural active agents to whiten the skin. During the tissue culture process of V. dunalianum， the base of the rooting plantlets obtained by the current culture medium often formed the callus， which significantly affected the survival rate after transplantation. In order to improve the rooting quality of the proliferation plantlets and survival rate of the transplanted plantlets of V. dunalianum. The optimum medium components for the root induction of the proliferation plantlets of V. dunalianum， including hormone types and concentrations， medium types and sucrose concentrations， were analyzed by the single factor experiment， and further probed the effects of different substrate ratios on the survival rate of the transplanted V. dunalianum plantlets in this study. The results showed that the medium types and the hormone types and their concentrations had more significant effects on the rooting rate than sucrose concentration. For the root induction， the optimal hormone and its concentration were IBA 2.0 mg·L-1， the optimal media was 1/4MS and the optimal sucrose concentration was 15 g·L-1. The most suitable medium for the root induction of the proliferation plantlets of V. dunalianum was 1/4MS+ IBA 2.0 mg·L-1+ activated carbon 0.1 mg·L-1+ sucrose 15 g·L-1， by which the rooting rate could reach 100%， and the average number of roots was 7.67 per plant. The root system of proliferation plantlets of V. dunalianum was radially extended and none callus was formed at the base of the rooting plantlets. In addition， the tissue culture plantlets of V. dunalianum grew strong and had dark-green leaves. For the transplantation of V. dunalianum plantlets， the optimal media for transplantation was the 100% humus， in which the survival rate reached 83.7%， and the tissue culture plantlets obtained by the experiments grew well and had healthy leaves. The optimization system established by this study， which had effectively improved the roots quality and rooting rate of the proliferation plantlets and the survival rate of the transplanted plantlets of V. dunalianum， and provided scientific and technological support for the large-scale production of high quality V. dunalianum plants.

Key words： Vaccinium dunalianum， hormone， rooting， transplanting， tissue culture plantlet

樟葉越桔（Vaccinium dunalianum）又名飯米果、長尾越桔，為杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）植物，多年生常綠灌木，生于山坡灌叢、闊葉林下或石灰山灌叢，稀附生常綠闊葉林中樹上，偶成喬木，全株可藥用，具有祛風除濕、舒筋活絡等功效，我國主產于云南、四川、貴州、西藏等地（方瑞征，1986）。本課題組研究發(fā)現(xiàn)樟葉越桔是一種富含熊果苷和咖啡酰熊果苷類物質的特殊民族資源植物，是廣泛應用于化妝品行業(yè)的皮膚美白天然活性劑原料熊果苷的主要植物來源之一（Zhao et al.，2008）。樟葉越桔幼嫩葉芽經過一系列工藝后在云南彝族民間作為茶代用品飲用，因形似雀嘴呈錐狀，又稱“雀嘴茶”，研究發(fā)現(xiàn)“雀嘴茶”和樟葉越桔陰干果實中氨基酸種類齊全，含量豐富，且含有豐富的礦質元素和營養(yǎng)素，有較高的營養(yǎng)和保健價值（楊芳等，2011;羅旭璐等，2014b）。樟葉越桔花冠淡綠帶紫紅色或淡紅色，還具有一定的觀賞價值，園林上可用于叢植或行道樹（王麗娜， 2010），同時在城市綠化上也有廣闊的應用前景。

樟葉越桔目前仍處于野生狀態(tài)，加上其原生環(huán)境遭受嚴重破壞、植株生長緩慢，導致樟葉越桔野生資源日益匱乏，其種質資源保護利用與優(yōu)良種繁育技術亟待開發(fā)。常用的林木種苗繁殖方式包括種子繁殖、扦插繁殖和組培繁殖等。有研究者以野生樟葉越桔種子為材料，研究了不同處理方法對樟葉越桔種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)樟葉越桔種子萌發(fā)率均低于70%（任國香等，2017），同時由于缺乏樟葉越桔優(yōu)良家系，種子繁殖易出現(xiàn)性狀分離。采用傳統(tǒng)的扦插繁殖技術開展樟葉越桔種苗繁育也存在需穗條多、對母株傷害大、繁殖速度慢等缺點。然而，組培快繁技術則是一種有效的樟葉越桔植物資源開發(fā)和保護技術。當前，國內外對越桔屬多種植物的組培快繁技術研究已有報道，使用組培快繁技術可使藍莓莖段成活率高達85.7%，愈傷組織誘導率可達88%（房小晶等，2014）;和加衛(wèi)和徐中志（2007）以云南越桔繼代培養(yǎng)的芽苗轉接于生根培養(yǎng)基中，生根率達78%，煉苗成活率在90%以上。目前，本課題組已就樟葉越桔的組織培養(yǎng)研究開展了一定的基礎工作，一方面以野生樟葉越桔幼嫩帶芽莖段為外植體，建立了樟葉越桔的組織培養(yǎng)與快速繁殖體系，外植體誘導萌發(fā)率為83.33%，生根率為86.67%（羅旭璐等，2014a）;另一方面以樟葉越桔組培苗葉片為研究材料，建立了樟葉越桔葉片誘導不定根的培養(yǎng)體系，并試圖通過定向培養(yǎng)植物細胞或組織來獲取熊果苷和咖啡酰熊果苷類物質等活性次生代謝產物（卜程洪等，2018）。但還沒有開展樟葉越桔生根苗的移栽煉苗研究。同時前期研究發(fā)現(xiàn)樟葉越桔繼代培養(yǎng)苗轉接于生根培養(yǎng)基中，雖然生根率超過了85%，但并未達到最佳;同時，現(xiàn)有生根配方獲得的組培生根苗基部還存在大量愈傷組織，導致移栽成活率低。

組培生根苗的質量直接會影響到移栽苗的成活率，進而決定種苗的培育成本，因此采用植物組織培養(yǎng)技術進行種苗生產，首先要有完整的組培工藝流程，其次要不斷優(yōu)化工藝流程，以不斷降低生產成本?；诖?，為了進一步完善樟葉越桔的組培快繁工藝流程，降低育苗成本，推進種苗的工廠化生產進程。本試驗在前期研究基礎上，以樟葉越桔繼代苗為材料，從生根激素類型及濃度的比較、基本生根培養(yǎng)基的篩選、糖分濃度的篩選和移栽基質配比的篩選開展了研究，旨在提高樟葉越桔組培苗生根率、生根質量以及移栽成活率，降低生產成本，為樟葉越桔的優(yōu)良植株的繁育和規(guī)模化生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以云南省武定縣產野生樟葉越桔離體培養(yǎng)后的繼代苗為試驗材料，由西南林業(yè)大學國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室培育。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料的預處理 將樟葉越桔叢生芽轉接在1/2MS + IAA 1.5 mg·L-1+ 活性炭0.1 g·L-1 + 蔗糖20 g·L-1 + 瓊脂5 g·L-1的培養(yǎng)基中進行壯苗處理2個月，獲得壯苗后的樟葉越桔繼代苗，并去除分裂素的影響，再挑選葉色濃綠、生長健壯、無污染的繼代苗接種在后續(xù)生根培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0;培養(yǎng)溫度為（25 ± 2）℃，光照強度3 000 lx，每天光照12 h;50 d后統(tǒng)計生根率;試驗于西南林業(yè)大學云南省高校林木生物技術重點實驗室進行。

1.2.2 不同激素類型及濃度對樟葉越桔組培苗生根的影響 以1/2MS + 瓊脂5 g·L-1+ 活性炭0.1 mg·L-1+ 蔗糖15 g·L-1為基礎培養(yǎng)基，設IBA（1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1），NAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1），IAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1）共12個處理，同時設置不加激素的空白對照組。每組處理30瓶，每瓶10顆苗，重復3次。

1.2.3 不同培養(yǎng)基對樟葉越桔組培苗生根的影響 設置了5種不同的培養(yǎng)基類型，分別為MS、1/2MS、1/4MS、1/8MS、WPM，其他添加成分有IBA 2.0 mg·L-1、瓊脂5 g·L-1 + 活性炭0.1 mg·L-1、蔗糖15 g·L-1。每組處理30瓶，每瓶10顆苗，重復3次。

1.2.4 不同糖分含量對樟葉越桔組培苗生根的影響 以1/4MS + IBA 2.0 mg·L-1+ 瓊脂5 g·L-1+ 活性炭0.1 mg·L-1為基礎培養(yǎng)基，設置了4種蔗糖濃度，分別為5、15、25、35 g·L-1。每組處理30瓶，每瓶10顆苗，重復3次。

1.2.5 不同基質配比對樟葉越桔組培苗移栽成活的影響 將生根培養(yǎng)基上植株健壯，葉片舒展，根系發(fā)達的生根苗放置移栽環(huán)境中閉瓶處理7 d后，從培養(yǎng)瓶小心取出并沖洗殘留培養(yǎng)基，移栽至煉苗基質中。煉苗移栽基質設全腐殖土、紅壤∶腐殖土（1∶1）、紅壤∶腐殖土（2∶1）、紅壤∶腐殖土（4∶1）共4個處理，每個處理均全面噴灑多菌靈，澆透水后第2天進行移栽，期間保證其空氣溫度不高于30 ℃，每個處理移栽50株樟葉越桔生根苗，重復3次，3個月后統(tǒng)計其成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS 19.0軟件統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)并進行顯著性分析。按照下列公式計算生根率和成活率：

生根率=（生根苗數(shù)/接種的總苗數(shù)）×100%;

成活率=（移栽后成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù)）×100%。

根據(jù)觀察根系發(fā)達、粗壯的程度把組培苗生根狀況描述為生根良好、生根較好、生根較差和生根差四個等級，表中“生根良好”記為“++++”，“生根較好”記為“+++”，“生根較差”記為“++”，“生根差”記為“+”。

2 結果與分析

2.1 不同激素類型及濃度對樟葉越桔組培苗生根影響

從表1可以看出，對照組的組培苗未生根，不同IAA濃度處理的組培苗生根效果有差異但不顯著，根的數(shù)量少，基部少量愈傷組織，其最高生根率為73.33%。不同濃度NAA處理下的組培苗生根率在隨著NAA濃度的增加逐漸提高，在NAA 2.0 mg·L-1處理下生根率達到80.00%，根系也隨之變得發(fā)達、粗壯，但根的數(shù)量少，基部有大量愈傷組織。不同濃度IBA處理的組培苗生根效果呈現(xiàn)顯著差異，隨著IBA濃度的升高，組培苗生根率呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢，在IBA 2.0 mg·L-1處理下其生根率達到最高，為81.67%，樟葉越桔的生根效果也最佳，根系發(fā)達、粗壯，呈輻射狀，基部無愈傷組織，植株葉片舒展（圖1，圖2）。

2.2 不同培養(yǎng)基對樟葉越桔組培苗生根影響

從表2可以看出，不同培養(yǎng)基處理的樟葉越桔組培苗生根率存在顯著性差異。其中：1/4MS培養(yǎng)基處理的組培苗生根率最高（達97.22%），根系數(shù)量多且粗壯，植株生長健壯（圖3，圖4）;其次是1/2MS的培養(yǎng)基，生根率達到81.67%，生根數(shù)量也較多，植株生長也較好。其他培養(yǎng)基處理的組培苗根系則較細、生根率較低、植株生長較弱。

2.3 不同糖分濃度對樟葉越桔組培苗生根影響

從表3可以看出，添加5～35 g·L-1蔗糖后，各處理組生根率均較高，其中蔗糖15 g·L-1處理下的組培苗生根率最高（達到100%），而且根數(shù)量也最多，長度最長，呈輻射狀，苗生長健壯，葉色濃綠（圖5，圖6）。

2.4 不同基質配比對樟葉越桔組培苗移栽成活影響

從表4可以看出，把樟葉越桔生根苗移栽入不同基質進行移栽馴化，發(fā)現(xiàn)移栽成活率隨著紅土比值的加大而逐漸降低，長勢也越來越差。最適的基質為全腐殖土，成活率最高（達到83.7%），且葉片舒展，生長狀況良好（圖7）。

3 討論與結論

本研究通過分析不同激素類型及濃度、培養(yǎng)基類型和糖質量濃度等因素對樟葉越桔組培苗生根的誘導影響，獲得樟葉越桔理想的生根培養(yǎng)基配方為1/4MS + IBA 2.0 mg·L-1 + 活性炭0.1 mg·L-1 + 蔗糖15 g·L-1，生根率最高可達100%;并進一步研究了不同基質配比對樟葉越桔移栽苗存活率的影響，得出樟葉越桔組培苗移栽時以全腐殖土基質為佳，成活率達83.7%。

在植物組培快繁過程中，組培苗的生根及煉苗移栽是該工藝流程中最后兩個核心環(huán)節(jié)。生根苗質量的好壞直接影響到后期的煉苗移栽，而移栽成活率的高低則直接影響組培快繁的生產成本。在組培苗的生根過程中，激素的類型及濃度對根系的形成最為關鍵。Ikeuchi et al.（2016）研究發(fā)現(xiàn)，植物能夠再生缺失的組織和器官，通過激素誘導可加快再生進程。生長素對不定根的誘導效果在不同的植物中表現(xiàn)不同（Abdulaziz & Bahrany，2002）。生長素IBA和NAA對不定根的誘導比生長素IAA要穩(wěn)定（AI-Juboory et al.，1998），有研究證明在多種植物中IBA對不定根的誘導作用效果較好（Prakash et al.，1999;Rani & Grover，1999;Fracro & Echeverrigaray，2001）。本研究比較了一定濃度范圍內的IAA、NAA和IBA三種激素對樟葉越桔組培苗生根的影響，結果表明IAA和NAA處理的樟葉越桔生根苗基部會存在大量愈傷組織，而IBA處理的樟葉越桔生根苗基部無愈傷組織，生根質量好，且生根率有隨著IBA濃度的升高先增加達到峰值后再降低的變化規(guī)律，這與野含笑（曹基武等，2015）、藍莓（韓德偉，2013）和篤斯越橘（王振武等，2015）等植物的變化規(guī)律類似。本研究表明IBA濃度為2.0 mg·L-1時，樟葉越桔組培苗生根率最高且根系發(fā)達，該IBA最適濃度高于前期課題組誘導樟葉越桔葉片產生不定根的IBA最適濃度1.0 mg·L-1 IBA（卜程洪等，2018），推測樟葉越桔組培苗的莖和葉片響應IBA誘導生根的敏感度存在一定的差異。另外，本試驗只研究了不同單一激素及濃度對樟葉越桔組培苗生根的影響，為了降低樟葉越桔組培快繁生產成本，進一步提高組培苗的生根質量，后續(xù)可從多種激素組合及其濃度對樟葉越桔組培苗生根的影響開展深入研究。

大量元素在對植物的生長發(fā)育有著極其重要的作用，除氮元素外，磷、鉀、鈣、鎂等元素都對植物細胞酶活性有一定影響，在植物新陳代謝過程中起著重要作用。程磊和胡宋英（2003）研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的Ca2+和Mg2+有助于誘導根的形成和生長。本研究結果表明1/4MS培養(yǎng)基處理的樟葉越桔組培苗生根率高、生根效果最好，MS培養(yǎng)基處理下的樟葉越桔組培苗不生根，推測是高濃度的大量元素（如Ca2+和Mg2+）對樟葉越桔組培苗生根有抑制作用。鄭小江和劉金龍（2001）在對天師栗莖芽組織培養(yǎng)研究中，也發(fā)現(xiàn)高濃度的無機鹽對生根有明顯的抑制作用。而1/8MS培養(yǎng)基較1/4MS培養(yǎng)基處理下的樟葉越桔組培苗生根率又有所下降，推測過低濃度的大量元素又無法滿足組培苗生根的營養(yǎng)需求，這與劉正娥等（2012）的研究結果類似。前期羅旭璐等（2014a）研究結果發(fā)現(xiàn)WPM是最適宜培養(yǎng)基，生根率為86.67%，而本研究結果顯示WPM培養(yǎng)基處理下的樟葉越桔組培苗生根率只有12.78%，且其根系生長差，原因可能與本研究中樟葉越桔組培苗生根處理前進行的壯苗處理有關，其中的內在機理還需要進一步深入研究。

糖作為組培苗生命活動的碳源和能源物質，同時具有調節(jié)滲透壓和提高植物耐鹽性的作用（劉麗萍，2006;龔建英，2019）。蔗糖在植物組織培養(yǎng)中得到了廣泛的應用，既可為植物生長提供能源，又可促進植物組織分化。有研究發(fā)現(xiàn)蔗糖對植物根的生長有一定的調節(jié)作用，嚴華兵等（2011）發(fā)現(xiàn)高蔗糖濃度能促進不定根的發(fā)生，張碩等（2012）卻發(fā)現(xiàn)蔗糖對小麥根的生長具有抑制作用，而De Faria et al.（2004）研究則表明不同蔗糖濃度對體外培養(yǎng)的石斛生根影響較小。本研究結果顯示不同蔗糖濃度處理的樟葉越桔組培苗生根率均高于85%，表明蔗糖濃度對樟葉越桔組培苗生根的影響較小。可見，蔗糖對植物組培苗根的生長影響因物種不同而不同。研究還發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入適量的活性炭，既可吸附植物細胞分泌的毒性物質以及培養(yǎng)基中有毒副作用的物質，也可為根的生長營造近似自然生長條件下的暗環(huán)境，因此，在生根培養(yǎng)基中添加活性炭可有利于生根（劉根林等，2001;張文泉等，2015;馮漢青等，2016）。

越桔屬植物根系較弱，沒有側根，組培苗移栽階段較難成活（梁曉晶等，2011），因此對基質的要求也較高。在組培苗移栽過程中，基質起著支持和固定植物的作用，為植物提供相對適宜的生長環(huán)境。不同基質的保濕性、透氣性和抗菌性等能力不同。樟葉越桔與藍莓（董朝莉，2011）、蔓越橘（張麗華，2012）、紅豆越橘（田新華等，2015）等同為越桔屬植物，比較適合生長在疏松多孔、富含有機質、酸性的人工基質中。試驗結果表明，采用全腐殖土處理的樟葉越桔組培苗移栽效果最好，煉苗成活率達83.7%，推測全腐殖土富含有機質且土質疏松透氣，利于植物幼苗生長。此外，由于試管苗從高濕恒溫的無菌環(huán)境轉移到低濕變溫的有菌環(huán)境，適應能力較弱（黃卓忠和嚴華兵，2007），因此，對環(huán)境的要求非常嚴苛，除對選用的移栽基質采取常規(guī)消毒處理外，移栽后的管護同樣尤為重要，嚴格控制好溫濕度，否則極易造成移栽苗死亡。

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