龍香娥 孫靜 周立 鄭霓亞 唐魯兵

【摘 要】目的：探討乳腺癌患者血漿中miR-503的表達(dá)水平。方法：采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)20例乳腺癌患者及15例健康志愿者血漿中miR-503的表達(dá)水平。結(jié)果：乳腺癌患者血漿miR-503表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P = 0.001）。結(jié)論：血漿miR-503在乳腺癌中的表達(dá)水平低于正常人，對(duì)于乳腺癌的診斷具有一定價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌; miR-503; 血漿

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)女性乳腺癌的發(fā)病率與死亡率正逐年增加，嚴(yán)重威脅著婦女的健康。早期診斷和早期治療是防治乳腺癌和降低死亡率的最有效的辦法。

目前應(yīng)用于臨床診斷乳腺癌的腫瘤標(biāo)志物主要有癌胚抗原（CEA）和糖類抗原153（CA153）等，但這些腫瘤標(biāo)志物在乳腺癌的早期中效能較差[1]，難以滿足早期診斷的需求。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度約18-25bp的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌與正常人中存在著差異表達(dá)的miRNA，這些差異表達(dá)的miRNA在乳腺癌的早期診斷中有較高效能[1]。miR-503為miRNA家族中的一員，不少研究報(bào)道m(xù)iR-503在不同細(xì)胞及組織中的差異表達(dá)。本研究的主要目的是通過應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)乳腺癌患者血漿與正常人群血漿中miR-503的表達(dá)水平，分析miRNA-503在乳腺癌患者血漿中的表達(dá)水平與正常人的差異，為miR-503有希望作為乳腺癌輔助診斷的分子標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象

選擇寧波市婦女兒童醫(yī)院乳腺癌住院患者20例（女性，年齡51.18±5.37歲）和15例健康體檢者（女性，年齡50.13±4.77歲）作為研究對(duì)象（兩組研究對(duì)象年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。所有患者均經(jīng)寧波市臨床病理診斷中心確診。收集各研究對(duì)象的外周靜脈血3ml至EDTA抗凝試管，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上層血漿于1.5mlEP管。所有血漿標(biāo)本放于-20°C冰箱凍存待測(cè)。

1.2 主要試劑及儀器

RNA提取試劑為美國(guó)Ambion產(chǎn)品Trizol LS reagent;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、U6及miR-300特異RT及PCR引物均購于寶生物工程有限公司（大連TAKARA公司）。實(shí)時(shí)定量PCR儀為美國(guó)Stratagene的 MX3005P PCR自動(dòng)系列化分析儀。

1.3 方法

1.3.1血漿總RNA提取及含量測(cè)定

使用抽提RNA試劑Trizol LS reagent抽提各樣本血漿總RNA，具體操作按照說明書進(jìn)行。抽提的RNA溶解于10 μl DEPC水中。使用分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA樣品260 nm和280 nm的吸收值，分析RNA的純度。OD260 / OD280在1.8～2.0時(shí)RNA純度較高。計(jì)算提取的RNA含量。

1.3.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-503的水平

使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按廠家說明書進(jìn)行操作。以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-503的表達(dá)水平。每一樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取其平均值，以U6為內(nèi)參，分別擴(kuò)增miRNA和U6小RNA，用Mx5035P QPCR System進(jìn)行反應(yīng)。Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到臨界閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。ΔCt = Ct miRNA - Ct U6;ΔΔCt = ΔCt實(shí)驗(yàn)組 - ΔCt對(duì)照組。以2-△Ct表示miR-503的相對(duì)表達(dá)水平，最后以2-△△Ct表示實(shí)驗(yàn)組miR-503的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組的差異倍數(shù)。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean ± SD）表示，樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，P < 0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

統(tǒng)計(jì)20例乳腺癌患者2-△Ct結(jié)果顯示，20例乳腺癌患者血漿中miR-503的相對(duì)表達(dá)水平為0.075±0.05，同樣方法得出對(duì)照組血漿中miR-503的相對(duì)表達(dá)水平為0.272±0.12，與正常人相比，乳腺癌患者血漿中miR-503的表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。通過2-△△Ct得出20例乳腺癌患者血漿中miR-503的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組的0.244，即對(duì)照組的miR-503的表達(dá)水平為實(shí)驗(yàn)組的4.10倍。若以對(duì)照組血漿中miR-503的相對(duì)表達(dá)水平的均數(shù)0.272為正常人血漿miR-503的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平，20例乳腺癌中有19例乳腺癌患者血漿中的miR-503表達(dá)水平不到正常人的1/2。具體結(jié)果見圖1。

3 討論

miRNA是人體內(nèi)廣泛存在的非編碼小分子RNA，與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，在人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等扮演著重要角色。miRNA與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，另外miRNA在乳腺癌的診斷和預(yù)后判斷等方面的作用也受到研究者的關(guān)注[2]。

miR-503為miRNA家族中的一員，可通過不同作用機(jī)制在多種癌癥如肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、前列腺癌等的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及治療等方面發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明miR-503在不同癌組織中有異常表達(dá)，與正常的癌旁組織及正常細(xì)胞相比，miR-503在許多癌組織及癌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯下降，如肺癌[3]、胃癌[4]等。但也有研究發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比miR-503在癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，如研究者發(fā)現(xiàn)miR-503在食管鱗癌[5]中表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮促癌作用。由此可見miR-503在不同癌組織及癌細(xì)胞中存在著表達(dá)水平的差異，這提示miR-503可能參與許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展，在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮抑癌或促癌作用。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-503在乳腺癌患者血漿中表達(dá)水平明顯下調(diào)，與正常人相比，miR-503在乳腺癌血漿中的表達(dá)僅為正常人的0.244。本研究將為miR-503有希望作為乳腺癌輔助診斷的分子標(biāo)志物提供了可能性。但是本研究還存在著不足，如病例標(biāo)本數(shù)量不多，非大樣本量的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否存在一定偏差等，需擴(kuò)大病例標(biāo)本數(shù)量、結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究等。

參考文獻(xiàn)

[1]姚穎，陸奎英，張敏，等.miR-10b與乳腺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物在早期乳腺癌中診斷效能比較.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2020，41（3）：310-317

[2]Hamam R， Hamam D， Alsaleh KA，et al. Circulating microRNAs in breast cancer： novel diagnostic and prognostic biomarkers. Cell Death Dis. 2017，8（9）：e3045.

[3]Wei Y， Liao Y， Deng Y， et al. MicroRNA-503 Inhibits Non-Small Cell Lung Cancer Progression By Targeting PDK1/PI3K/AKT Pathway. Onco Targets Ther. 2019，12：9005-9016.

[4]Li W， Li J， Mu H， et al. MiR-503 suppresses cell proliferation and invasion of gastric cancer by targeting HMGA2 and inactivating WNT signaling pathway. Cancer Cell Int. 19：164.

[5]Liu ZH， Chen LD， He YB， et al. Study of expression levels and clinical significance of miR-503 and miR-375 in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2019，23（9）：3799-3805.

基金項(xiàng)目：

浙江省教育廳一般科研項(xiàng)目（編號(hào)：Y201534751）

作者簡(jiǎn)介：

龍香娥（1984-），女，湖南邵陽，碩士，講師，研究方向：從事腫瘤分子生物學(xué)研究。