趙品勇 孟祥林 周燕萍

【摘 要】目的：研究全反式維甲酸（ATRA）聯(lián)合奧沙利鉑（L-OHP）對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制作用。方法：將人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721用含有胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)后，用MTT法對(duì)不同樣品試劑對(duì)細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：培養(yǎng)48 h后ATRA組與L-OHP組一部分細(xì)胞凋亡;聯(lián)合各組細(xì)胞明顯減少;但在作用72 h后，各組凋亡細(xì)胞無顯著增加。48 h時(shí)各組藥物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用最明顯;ATRA聯(lián)合L-OHP各組的作用最顯著，與其他組相比，P<0.05;各聯(lián)合組之間無顯著差異。結(jié)論：ATRA聯(lián)合L-OHP可加強(qiáng)對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制作用。

【關(guān)鍵字】ATRA;L-OHP;人肝癌細(xì)胞SMMC-7721;抑制作用

【Abstract】Objective： To study the inhibition effect of Tretinoin（ATRA） combined with third Oxalipatin（L-OHP） on human hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721. Methods： Human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 was cultured in a medium containing fetal bovine serum， and the inhibitory effects of different sample agents on the cells were detected by MTT method. Results： After 48 hours of incubation， some cells in ATRA group and L-OHP group were broken and apoptotic， while the number of cells in combination group decreased significantly; but there was no significant increase in apoptotic cells in each group after 72 hours of incubation. At 48 hours， the inhibition of each group on SMMC-7721 cells was the most obvious. Compared with other groups， the effect of ATRA combined with L-OHP was the most significant， P < 0.05; but there was no significant difference among the combined groups. Conclusion： ATRA combined with the third generation platinum anticancer compounds can enhance the inhibition of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells.

【Key words】 ATRA; L-OHP; Human hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721; Inhibition

肝癌，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌兩種，人們常說的肝癌多指原發(fā)性肝癌，而原發(fā)性肝癌85%-90%為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是我國最常見的惡性腫瘤之一。當(dāng)機(jī)體組織細(xì)胞不受體內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制的控制，發(fā)生多次遺傳突變和積累，則產(chǎn)生癌變，而從細(xì)胞凋亡的角度來看，腫瘤的發(fā)生是由于凋亡受阻所致。因此，選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為治療惡性腫瘤的重要手段之一。有研究文獻(xiàn)資料表明[1]，全反式維甲酸（Tretinoin， ATRA）可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡。奧沙利鉑（Oxalipatin， L-OHP） 屬第3代鉑類抗腫瘤化合物，可抑制DNA的合成，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[2]。本研究通過比較不同樣品試劑對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制作用，探討ATRA聯(lián)合L-OHP能否加強(qiáng)對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制作用，為藥物聯(lián)合使用治療肝細(xì)胞癌提供線索和參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721購自中科院上海藥物研究所;胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司;ATRA、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲

基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司， 其中，ATRA用無水乙醇配制成濃度為10-2mol/L、MTT用PBS液配制成濃度5 g/L、DMSO除菌后，于-20 ℃冰箱中存儲(chǔ);注射用奧沙利鉑（0.1/支），齊魯制藥（海南）有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：EA2E7001A。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 BKQ-B50II立式高壓蒸汽滅菌器，博科控股集團(tuán)有限公司;SW-CJ-1BU單人單面凈化工作臺(tái)，浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司;37XB倒置顯微鏡，上海永享光學(xué)儀器制造有限公司;移液器，上海榮泰生化工程有限公司;GZX-GF-MBS-1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;TGL-18M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;優(yōu)普UPR-II-5TNZ純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司;BDF-86V158立式實(shí)驗(yàn)室冰箱，博科控股集團(tuán)有限公司;SP-756P紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng) 常規(guī)消毒超凈臺(tái)，取出裝有人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的凍存管，迅速放入37℃水浴，輕輕搖動(dòng)凍存管使細(xì)胞懸液融化，于超凈臺(tái)內(nèi)將細(xì)胞懸液移至10 mL的離心管內(nèi)，用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)液稀釋至原體積的4倍，1000 rpm離心5 min，棄上清液后加新鮮培養(yǎng)液，輕輕吹打使沉于離心管底部的細(xì)胞變?yōu)榛鞈覡顟B(tài)，后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，保持較高的細(xì)胞密度，用 0.25%胰蛋白酶消化，傳代（觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底或液體變黃，則傳代、更換培養(yǎng)液）。

1.2.2 細(xì)胞分組 分組：空白組：無細(xì)胞懸液，只添加100μL的培養(yǎng)基;平行對(duì)照組：1 mL/L無水乙醇;ATRA組10-5 mol/L ATRA（濃度設(shè)定參照相關(guān)醫(yī)學(xué)研究[3]）; L-OHP組1-L-OHP組3的 L-OHP濃度（濃度設(shè)定參照相關(guān)醫(yī)學(xué)研究[4]）分別為10mg/L、20mg/L、40mg/L;聯(lián)合組1：10-5 mol/L ATRA、10 mg/L L-OHP）、聯(lián)合組2：10-5mol/L ATRA、20 mg/L L-OHP;聯(lián)合組3：10-5 mol/L ATRA、40 mg/L L-OHP。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，對(duì)其經(jīng)過消化、離心后用含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整到細(xì)胞密度為1×105/mL，用加樣槍吸取90μL細(xì)胞懸液分別移入到96孔板的9個(gè)孔內(nèi)（此前先用適量的含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基鋪底，空白組不加細(xì)胞懸液），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，確定細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，按照上述的分組情況添加對(duì)應(yīng)的試劑和藥物。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、生長(zhǎng)抑制率檢測(cè) 觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長(zhǎng)曲線：確定細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)良好并按照上述的分組情況添加對(duì)應(yīng)的試劑和藥物后，于24h、48 h、72 h時(shí)在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。生長(zhǎng)抑制率檢測(cè)：采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率檢測(cè)，分別在24h、48 h、72 h時(shí)將5 g/L的MTT溶液20μL加入到9組培養(yǎng)基中，對(duì)應(yīng)的時(shí)間段再4h后加入150μL的DMSO振蕩10 min，檢測(cè)490 nm處各孔吸光度（A ）值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，若P<0.05，則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 培養(yǎng)48 h后，平行對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)正常;ATRA組部分細(xì)胞斷裂、凋亡，細(xì)胞間隙增寬;L-OHP組1-L-OHP組3基本相同。聯(lián)合組大部分細(xì)胞斷裂、凋亡明顯，細(xì)胞明顯減少;但在作用72 h后，各組凋亡細(xì)胞增加數(shù)量并不顯著。

2.2人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制作用 在培養(yǎng)48 h時(shí)，ATRA對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制作用最明顯，其他各組在這一時(shí)期對(duì)該細(xì)胞的抑制作用也最為明顯。其中，以采用聯(lián)合組的抑制作用最為顯著，與單一用藥相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;L-OHP組1-L-OHP組3之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;各聯(lián)合組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表1和圖1。

3 討論

細(xì)胞凋亡（apoptosis）指為了維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，是一個(gè)主動(dòng)的過程，1972年Kerr等三位科學(xué)家首先提出了細(xì)胞凋亡這一概念。目前認(rèn)為，惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)失控、增殖過度是產(chǎn)生腫瘤的一個(gè)途徑;細(xì)胞凋亡受阻，不能進(jìn)行正常的組織清除是產(chǎn)生腫瘤的另一個(gè)途徑。從而導(dǎo)致組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞存活延長(zhǎng)，使細(xì)胞群體內(nèi)存活與死亡的平衡被破壞，存活大于死亡，腫瘤增長(zhǎng)數(shù)目的凈增長(zhǎng)加大[5]。深入研究細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，有利于開發(fā)相應(yīng)的抗腫瘤藥物，從而達(dá)到阻斷腫瘤發(fā)生和發(fā)展的可能。目前發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素也有很多，如射線、藥物等，通過這些因素研究出誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法越來越多，用于臨床抗腫瘤的治療手段也越來越豐富，效果越來越好，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗腫瘤藥物也隨之產(chǎn)生而發(fā)揮了很好的臨床治療作用。本研究中的藥物試劑全反式維甲酸（Tretinoin， ATRA）可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化成熟和凋亡，在提高化療敏感性方面，也具有一定的作用[6]。ATRA是動(dòng)物體內(nèi)維生素A的代謝中間產(chǎn)物，是動(dòng)物肢體再生過程中必不可缺的物質(zhì)，有著廣泛的生理學(xué)和藥理學(xué)活性。奧沙利鉑（Oxalipatin， L-OHP）是第三代鉑類抗腫瘤化合物，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA形成鏈間和鏈內(nèi)交聯(lián)而中斷DNA合成，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。由于兩種藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞作用機(jī)制不同，從理論上講，將ATRA與第三代鉑類抗癌化合物奧沙利鉑聯(lián)合起來，能夠綜合發(fā)揮兩種藥物在人肝癌細(xì)胞SMMC-7721抑制方面的優(yōu)勢(shì)作用，從而加強(qiáng)對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的破裂和凋亡，進(jìn)而顯著降低肝癌細(xì)胞的數(shù)量[8]。

本次研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果，培養(yǎng)48 h后ATRA組與L-OHP組1- L-OHP組3部分細(xì)胞斷裂凋亡;聯(lián)合各組細(xì)胞明顯減少;但在作用72 h后，各組凋亡細(xì)胞無顯著增加。48 h時(shí)各組藥物對(duì)細(xì)胞SMMC-7721的抑制作用最明顯;ATRA聯(lián)合L-OHP各組的作用最顯著，與其他組相比，P<0.05;各聯(lián)合組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），和相關(guān)醫(yī)學(xué)[9]研究結(jié)果相符。綜合本次實(shí)驗(yàn)的研究數(shù)據(jù)，驗(yàn)證了ATRA聯(lián)合L-OHP可加強(qiáng)對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞的破裂、凋亡。而聯(lián)合用藥的目的為發(fā)揮藥物的協(xié)同作用以提高療效;延遲和減少耐藥的發(fā)生;減少藥物劑量，從而減少藥物不良反應(yīng)。用于腫瘤的化療藥物中，大部分藥物有較多的不良反應(yīng)，常見的是胃腸腸道反應(yīng)（惡心、嘔吐），最嚴(yán)重是骨髓抑制。腫瘤化療方案中多采用聯(lián)合用藥的方式減少藥物劑量，達(dá)到提高療效或（和）減少不良反應(yīng)的目的。本研究的結(jié)果顯示，ATRA聯(lián)合第三代鉑類抗癌化合物L(fēng)-OHP對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721具有顯著的抑制作用，且聯(lián)合組1中較少劑量的L-OHP與其余劑量較高的聯(lián)合組對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用相當(dāng)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，減少藥物用量可達(dá)到相同的抑制作用。本文結(jié)論可為進(jìn)一步探討ATRA聯(lián)合L-OHP使用治療肝細(xì)胞癌提供線索和參考依據(jù)，對(duì)其是否有確切的臨床意義還需進(jìn)一步的研究論證。

參考文獻(xiàn)

[1]李甲振，張懷栓，鎬英杰等.全反式維甲酸聯(lián)合干擾素-β對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63的生長(zhǎng)抑制作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2012，29（2）：308-311.

[2]陶曉明，馮翠，李虎生等.三氧化二砷、全反式維甲酸聯(lián)合化療治療初發(fā)急性早幼粒細(xì)胞白血病的臨床觀察[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2013，26（1）：18-21.

[3]邵杰.人參皂苷Rg3及其與奧沙利鉑和索拉非尼聯(lián)合誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)，2012，36（7）：173-178.

[4]楊占風(fēng)，倪克梁，林萬隆等圍介手術(shù)期聯(lián)合應(yīng)用IFN-a及ATRA治療肝癌的機(jī)制探討[J].中華肝膽外科雜志，2010，28（4）：295-299.

[5]楊全會(huì)，許榮焜. 細(xì)胞凋亡與腫瘤[J]. 生理學(xué)科進(jìn)展， 2006， 37（4）： 373-378.

[6]朱喜丹，陳梅，馮林等.全反式維甲酸聯(lián)合三氧化二砷治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的療效觀察[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（3）：309-310，312.

[7]宮經(jīng)新，孟建波，馬悅等.全反式維甲酸聯(lián)合復(fù)方黃黛片序貫維持治療對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病長(zhǎng)期療效的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（11）：1473-1476.

[8]李海燕，曹勵(lì)民，賀紅艷等.全反式維甲酸對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其分子機(jī)制[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，39（2）：232-235，封2，后插1.DOI：10.7694/jldxyxb20130209.

[9]Jiang Y， Yu X， Su C， etal.Chitosan nanoparticles induced the antitumor effect in hepatocellular carcinoma cells by regulating ROS-mediated mitochondrial damage and endoplasmic reticulum stress[J].Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019，47（1）：747-756.