魏月娟 韓琳 高占義

摘要 目的：觀察強(qiáng)心方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌重構(gòu)的影響，探討其治療心肌梗死后心力衰竭大鼠的作用機(jī)制。方法：選取結(jié)扎左冠狀動脈法制備大鼠心肌梗死后慢性心力衰竭動物模型;將心肌梗死的54只大鼠隨機(jī)分為強(qiáng)心方組、纈沙坦組、模型組，每組18只，另選10只為對照組，對照組大鼠穿線后不行冠脈結(jié)扎，其余操作同模型組。12周后通過彩色多普勒超聲心動圖檢測左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVDs）、射血分?jǐn)?shù)（EF）;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）測定血漿鈣調(diào)磷酸酶（CaN）的水平;采用Western Blotting法檢測心肌鈣調(diào)控蛋白肌漿網(wǎng)鈣泵（SERCA2a）、雷尼丁受體2（RYR2）、活化T細(xì)胞核因子（NFAT3）蛋白表達(dá)。結(jié)果：模型組即未經(jīng)中藥和西藥灌胃治療的大鼠心功能明顯下降，心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2表達(dá)均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;CaN、NFAT3的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。給予強(qiáng)心方灌胃治療后強(qiáng)心方組，大鼠的心功能得到明顯的改善，心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2的表達(dá)得到明顯的升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），CaN、NFAT3水平明顯降低。結(jié)論：強(qiáng)心方能夠有效的改善心力衰竭大鼠的心功能，改善鈣回攝及鈣釋放，抑制心肌重構(gòu)，其作用機(jī)制可能與抑制CaN-NFAT3信號通路相關(guān)。

關(guān)鍵詞 強(qiáng)心方;慢性心力衰竭;鈣循環(huán);CaN-NFAT3信號通路;心肌舒縮功能;心肌重構(gòu);肌漿網(wǎng)鈣泵;心肌興奮收縮耦聯(lián);慢性心力衰竭動物模型

Abstract Objective：To observe the effects of Qiangxin Recipe on myocardial remodeling in rats with heart failure after myocardial infarction and to explore its mechanism of action in treating heart failure rats after myocardial infarction.Methods：Model of heart failure after myocardial infarction was prepared by left coronary artery ligation.Lavage treatment was given.The LVDd，LVDs and EF were measured by color Doppler echocardiography after 12 weeks.The level of plasma CaN was measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expressions of SERCA2a，RYR2 and NFAT3 in cardiac muscle were detected by Western-blot.Results：The cardiac function of model rats decreased significantly.The expression of SERCA2a and RYR2 in myocardium decreased significantly（P<0.05），and the difference was statistically significant.The contents of CaN and NFAT3 were significantly increased，and the difference was statistically significant.After Qiangxin Recipe intervention，it can effectively improve the heart function of rats，and significantly increase the protein expression of SERCA2a and RYR2（P<0.05）.The contents of CaN and NFAT3 were significantly decreased.Conclusion：Qiangxin Recipe can effectively improve cardiac function，improve calcium remission and calcium release，and inhibit myocardial remodeling in rats with heart failure，and its mechanism may be related to the inhibition of CaN-NFAT3 signaling pathway.

Key Words Qiangxin Recipe; Chronic heart failure; Calcium cycle; CaN-NFAT3 signal pathway; Myocardial contraction function; Myocardial remodeling; Myoplasmic reticulum calcium pump; Myocardial excitatory contraction coupling; Chronic heart failure animal model

中圖分類號：R289.5;R541.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.021

采用結(jié)扎左冠狀動脈法制備大鼠心肌梗死后慢性心力衰竭動物模型[1]。一般情況，在該手術(shù)結(jié)束后2周，大鼠即形成心力衰竭模型，心肌梗死后8周，大鼠已處于心力衰竭中晚期，在中醫(yī)辨證上，屬心腎兩虛階段;強(qiáng)心方由古方真武湯化裁而來，方藥組成有：附子、白芍、白術(shù)、茯苓、淫羊藿等;具有溫陽、利水、補(bǔ)腎、活血等功效;主要治療心力衰竭之心腎陽虛證。臨床治療效果已被證實，其作用機(jī)制尚不明確。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量（200±10）g。由河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物實驗中心提供，飼養(yǎng)觀察室溫度：（20±2）℃，相對濕度：40%～50%，給予標(biāo)準(zhǔn)光照周期（12 h光照/12 h黑夜）。

1.1.2 藥物 中藥：熟附子、豬苓、茯苓、白術(shù)、白芍、鹿角、骨碎補(bǔ)、黃芪、川芎、桃仁、紅花、甘草等12味中藥組成，均由滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供，并于此院中藥房完成制劑;西藥：纈沙坦膠囊（代文）由施維雅（天津）制藥有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要試劑與儀器

CaN試劑盒（美國R&B公司）;由奧爾科特科技生物有限公司生產(chǎn)的ALC-V8S小動物呼吸機(jī);上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司的心電圖機(jī);Philips iu22型彩色多普勒診斷儀;自制的小動物手術(shù)操作臺。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

腹腔注射氯胺酮全麻SD大鼠，行氣管插管，連接動物呼吸機(jī)。切開皮膚，逐層打開胸腔，使心臟暴露在視野下。在心臟左心耳下2～3 mm處結(jié)扎左冠狀動脈前降支，結(jié)扎后左室壁的顏色變白，同時可見室壁運(yùn)動減弱。心電監(jiān)護(hù)顯示Ⅱ?qū)?lián)R波振幅明顯升高，或J點上移，或ST段明顯抬高，證實心肌梗死模型制備成功。將心肌梗死的54只大鼠隨機(jī)分為強(qiáng)心方組、纈沙坦組、模型組，每組18只，另選10只做對照組，對照組大鼠穿線后不行冠脈結(jié)扎，其余操作同模型組。制備模型及灌胃給藥術(shù)后8周。

1.2.2 給藥方法

根據(jù)“實驗動物與人按體表面積等效量換算比率”計算，對照組和模型組均給予等體積蒸餾水;纈沙坦組予以纈沙坦懸濁液灌胃，給藥劑量為8 mg/kg;強(qiáng)心方組予以強(qiáng)心方水溶液灌胃，給藥劑量為0.9 g/kg。給藥1次/d，4周為1個療程。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

心臟彩超檢測：灌胃治療4周后，采用探頭頻率12.0MHz的多普勒超聲診斷儀檢測心臟的結(jié)構(gòu)及功能的各項指標(biāo)。大鼠經(jīng)氯胺酮腹腔麻醉后，固定，胸前備皮，于左胸骨旁取左心長軸觀和左室乳頭肌短軸觀。檢測左室舒張末期內(nèi)徑（Left Ventricular End Diastolic Diameter，LVDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（Left Ventricular End-systolic Diameter，LVDs）及射血分?jǐn)?shù)（Ejection Fraction，EF）。

大鼠血漿CaN的測定：采用腹主動脈取血，將抽取的血液置于抗凝管內(nèi)，用來分離血漿。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）分別測定血漿大鼠鈣調(diào)磷酸酶（CaN）的含量，其檢測步驟按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

心肌相關(guān)蛋白表達(dá)的測定：提取心肌組織，采用Western blotting 法測定SERCA2a、RYR2、NFAT3蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較均用單因素方差分析法;對于方差齊的數(shù)據(jù)，兩兩比較用最小顯著差法（LSD法）;以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能比較 與對照組比較，模型組大鼠LVDd、LVDs水平明顯升高，EF明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明結(jié)扎冠脈后大鼠心功能顯著下降。與模型組比較，纈沙坦組能降低心力衰竭大鼠LVDd、LVDs水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），升高EF水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;強(qiáng)心方組亦能降低心力衰竭大鼠VDd、LVDs水平，升高EF水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠SERCA2a、RYR2蛋白相對表達(dá)比較 ?與對照組比較，模型組大鼠心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2蛋白相對表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)治療后，與模型組比較，強(qiáng)心方組心肌鈣調(diào)蛋白SERCA2a、RYR2蛋白相對表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<;0.05）;而西藥纈沙坦組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠血漿CaN、NFAT3比較 與對照組比較，模型組大鼠血漿CaN活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，強(qiáng)心方組、纈沙坦組大鼠血漿CaN活性均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。強(qiáng)心方組下調(diào)CaN水平優(yōu)于纈沙坦組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

與對照組比較，模型組大鼠NFAT3蛋白質(zhì)表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，強(qiáng)心方組、纈沙坦組能降低心力衰竭大鼠中心肌細(xì)胞NFAT3蛋白質(zhì)表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;強(qiáng)心方組下調(diào)NFAT3水平優(yōu)于纈沙坦組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

慢性心力衰竭是指因各種原因?qū)е滦呐K結(jié)構(gòu)和功能異常，如擴(kuò)張型心肌病，缺血性心肌病，心包炎性心肌病，肥厚型心肌病，風(fēng)濕性心臟病，瓣膜性心臟病，心律失常性心肌病等，為各種病因所致的心臟病的終末狀態(tài)，最終致使心臟充盈和射血能力受阻的一組臨床綜合征。研究顯示，心肌重構(gòu)是慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本病理病機(jī)。當(dāng)各種原因?qū)е录?xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高時能夠激活CaN-NFAT3信號通路，該通路的活化是心室重構(gòu)的最重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[2-3];鈣循環(huán)在心肌興奮收縮偶聯(lián)中占有主導(dǎo)地位，研究顯示，Ca2+在心肌中的循環(huán)主要包括Ca2+回攝、Ca2+釋放及Ca2+儲存[4]，心肌細(xì)胞的舒張功能主要與胞質(zhì)Ca2+清除和交換相關(guān)，而胞質(zhì)內(nèi)Ca2+清除主要是通過SERCA2a再攝取[5];而心肌細(xì)胞的收縮性與Ca2+釋放密切相關(guān)，Ca2+釋放是由胞質(zhì)內(nèi)LTCC、RyR2的狀態(tài)以及肌漿網(wǎng)鈣泵含量等因素決定[6]?？梢姡渲忻恳粋€過程的異常都會導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+循環(huán)的破環(huán)，促使Ca2+的失去穩(wěn)定的交換狀態(tài)，這種破壞是心力衰竭心肌細(xì)胞舒縮功能下降的最主要原因。

研究表明，目前臨床上增強(qiáng)心肌收縮力的藥物的主要是通過增加Ca2+水平，進(jìn)而增加心肌收縮功能，如洋地黃類藥物;而研究顯示，長期的Ca2+水平增加可導(dǎo)致鈣超載現(xiàn)象，這種現(xiàn)象會導(dǎo)致心肌收縮和舒張功能減退，如使用強(qiáng)心藥早期會導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的升高，加強(qiáng)心肌收縮力，增強(qiáng)心臟射血功能，但是Ca2+的持續(xù)增高使Ca2+與肌鈣蛋白解離過程發(fā)生障礙，使心肌舒張功能發(fā)生障礙，心肌如果不能完全舒張，會直接導(dǎo)致心臟儲存功能下降，間接影響心肌射血功能，使有效循環(huán)血量明顯減少[7]。再者，鈣超載可誘導(dǎo)心肌肥厚信號通路CaN-NFAT3的激活，Ca2+增多可以CaN的活化，CaN可以促使NFAT3去磷酸化，去磷酸化的NFAT3轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核，與心肌細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子如鋅指轉(zhuǎn)錄因子（GATA4）相互作用，能夠活化多種導(dǎo)致心肌肥大及心肌肥厚的相關(guān)基因[8]，如可以調(diào)節(jié)心臟中ANF、BNP、β-MHC等肥大基因特異性表達(dá)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞蛋白核酸合成增加[9]，隨而出現(xiàn)心肌肥厚，心腔擴(kuò)大，心室重構(gòu)等病理過程，最終導(dǎo)致心力衰竭。本實驗從中醫(yī)中藥理論探討中醫(yī)中藥對于心力衰竭的作用機(jī)制，研究其改善鈣循環(huán)、善心肌舒縮功能、改善心肌重構(gòu)的機(jī)制。

心力衰竭歸屬于中醫(yī)學(xué)“喘證”“心悸”“水腫”等范疇;中醫(yī)學(xué)講心主血脈、為五臟六腑之大主，關(guān)于其病因病機(jī)的描述最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《諸病源候論》亦有“心主血脈”之說，心主血脈是指心氣調(diào)節(jié)和推動血液運(yùn)行于脈中，流注全身，循環(huán)不止，發(fā)揮營養(yǎng)和濡潤五臟六腑、形體官竅的作用。由此可見，心氣的推動對血液在脈中的正常運(yùn)行起到關(guān)鍵的作用。因心氣根于腎氣，心之陽氣全賴腎陽的溫煦，久病心疾，久必及腎[10]，所以心腎常為一體。如張建偉[11]提出治療慢性心力衰竭可以從溫補(bǔ)腎氣、溫補(bǔ)腎陽入手。資料表明，在近幾年中醫(yī)治療慢性心力衰竭的中醫(yī)治療原則中，90%左右采用溫腎利水、補(bǔ)氣活血之法，臨床效果顯著[12-14]，所以本研究使用具有溫補(bǔ)心腎作用的強(qiáng)心方治療慢性心力衰竭，探討其作用機(jī)制。

強(qiáng)心方組方主要有熟附子，豬苓，茯苓，白術(shù)，白芍，鹿角，骨碎補(bǔ)，黃芪，川芎，桃仁，紅花，甘草12味中藥;其中黃芪、附子、鹿角片有增強(qiáng)心肌收縮力、改善心肌缺血、抗血栓形成、抗休克等作用[15]。白芍能明顯延長常壓缺氧，亦能延長異丙腎上腺素所致心肌缺氧動物存活時間，還能拮抗有垂體后葉素造成的急性心肌缺血，增加心肌血流量，延長失血性休克心臟停搏時間[16]。茯苓、豬苓主要體現(xiàn)在利尿的作用上;白術(shù)能減慢心率、降低心肌耗氧及利尿作用[17]。骨碎補(bǔ)能增加心肌營養(yǎng)性血流量，并對垂體后葉素所致小鼠急性心肌缺血有保護(hù)作用[18]。西醫(yī)藥理學(xué)研究也顯示，此方對心力衰竭的治療有顯著效果。

綜上所述，自擬強(qiáng)心組方能夠改善心力衰竭大鼠的心功能，降低心力衰竭大鼠LVDd、LVDs水平，升高EF水平，能夠增加SERCA2a、RyR2蛋白表達(dá)，增加Ca2+回攝、Ca2+釋放功能，提高心肌細(xì)胞的舒張和收縮速率，改善鈣循環(huán)，促進(jìn)鈣穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而改善心肌舒張和收縮功能;再者，中藥強(qiáng)心方能夠降低CaN活性，下調(diào)NFAT3水平，抑制CaN-NFAT3信號通路，進(jìn)而抑制心肌重構(gòu)，其作用機(jī)制可能與改善鈣循環(huán)有關(guān)。

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（2017-12-06收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）