邊雨 姜文月 王美慧 任緒華 曲佳樂 李敏 高陸

摘 要 目的：建立六味地黃膠囊快速無損的質(zhì)量控制方法。方法：利用聲光可調(diào)濾光器（AOTF）-近紅外（NIR）光譜技術。以某廠家近3年生產(chǎn)的80批六味地黃膠囊為樣本，采用高效液相色譜法測定其中馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚、芍藥苷、熊果酸的含量，并按2015年版《中國藥典》（一部）通則方法測定其中水分含量。隨后，應用The Unscrambler定量分析軟件，以70批樣品組成校正集樣品，采用偏最小二乘法和交叉-驗證法分別建立六味地黃膠囊中上述6個指標的NIR定量模型；并以剩余10批樣品為驗證集樣品，對模型進行外部驗證。結(jié)果：所建立的馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚、芍藥苷、熊果酸、水分定量模型內(nèi)、外部驗證相關系數(shù)（R2）均大于0.9，校正標準偏差（RESEC）分別為0.372 8、0.025 4、0.263 3、0.288 5、0.186 7、0.037 7；預測標準偏差（RESEP）分別為0.462 2、 0.077 5、0.472 1、0.634 9、0.293 4、0.206 9。外部驗證結(jié)果顯示，各指標預測值與真實值的平均偏差分別為6.04%、6.05%、5.87%、6.97%、5.62%、4.83%，均小于10%。結(jié)論：建立的方法可實現(xiàn)六味地黃膠囊質(zhì)量的快速、無損分析。

關鍵詞 聲光可調(diào)濾光器-近紅外光譜技術；六味地黃膠囊；質(zhì)量控制；馬錢苷；莫諾苷；丹皮酚；芍藥苷；熊果酸；水分

Methodology Study on Rapid Quality Control of Liuwei Dihuang Capsule by AOTF-near Infrared Spectroscopy

BIAN Yu1，JIANG Wenyue1，WANG Meihui1，REN Xuhua1，QU Jiale1，LI Min2，GAO Lu1（1.Jilin Modern Chinese Medicine Engineering and Research Center Co.， Ltd.， Changchun 130012， China；2.Xiuzheng Pharmaceutical Group Co.， Ltd.， Jilin Tonghua 134001， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for the rapidly non-destructive quality control of Liuwei dihuang capsule. METHODS： AOTF-NIR spectrometry was adopted. Taking 80 batches of Liuwei dihuang capsule produced by a manufacturer in recent three years as samples， HPLC chromatogram was adopted to determine the contents of loganin， morroniside， paeonol， paeoniflorin and ursolic acid； the content of water was determined according to general principles stated in 2015 edition of Chinese Pharmacopeia （part Ⅰ）. Taking 70 batches of samples as correction set， the partial least square method and the cross-validation algorithm were used to establish the NIR quantitative model of 6 indexes in Liuwei dihuang capsules with the Unscrambler quantitative analysis software. Taking residual 10 batches of samples as validation set， external validation was conducted for the model. RESULTS： The correlation coefficients （R2） of internal and external validation of loganin， morroniside， paeonol， paeoniflorin， the content of water quantitative model were all greater than 0.9； the correction of standand deviation （RMSEC） were 0.372 8， 0.025 4， 0.263 3， 0.288 5， 0.186 7 and 0.037 7； the prediction of standard deviation （RMSEP） were 0.462 2， 0.077 5， 0.472 1， 0.634 9， 0.293 4 and 0.206 9； the external verification showed that mean deviations of preclicted value to actual value were 6.04%， 6.05%， 5.87%， 6.97%， 5.62% and 4.83%， with the mean deviation less than 10%.CONCLUSIONS：The established method can achieve rapidly non-destructive analysis Liuwei dihuang capsule.

KEYWORDS AOTF-NIR spectrometry； Liuwei dihuang capsule； Quality control； Loganin； Morroniside； Paeonol； Paeoniflorin； Ursolic acid； Content of water

六味地黃膠囊是中藥補益劑中滋補益腎的代表方劑，處方由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、澤瀉、山藥、茯苓組成，為2015年版《中國藥典》（一部）（后文簡稱“藥典”）收錄的成方制劑，在藥典標準中含量測定項下規(guī)定，分別以薄層色譜掃描法測定其酒萸肉中熊果酸含量和高效液相色譜法測定其牡丹皮中丹皮酚的含量[1]。現(xiàn)有檢測方法分析過程復雜，操作過程煩瑣，無法滿足企業(yè)生產(chǎn)的工業(yè)要求；并且，六味地黃膠囊處方藥材種類較多，藥典標準中僅測定了其中2種成分，不能全面地反映產(chǎn)品質(zhì)量。為更全面地表征該產(chǎn)品質(zhì)量，含量檢測指標的選擇需盡量覆蓋處方中主要藥味。

近紅外（NIR）光譜技術具有快速、簡便、無污染以及可實現(xiàn)多個指標同步檢測等優(yōu)點，作為一種“綠色”分析技術，優(yōu)勢突出，能夠有效地應用于大批樣品的快速檢測，特別是對于日常的質(zhì)量監(jiān)控，是一種十分經(jīng)濟且快速的技術手段[2-6]。目前，該技術在六味地黃制劑的質(zhì)量控制研究方面應用較多，如胡浩武等[7]將聲光可調(diào)濾光器（AOTF）-NIR光譜技術用于濃縮六味地黃丸提取濃縮過程理化指標快速分析；史會齊等[8]采用NIR光譜技術快速測定六味地黃丸中水分含量；宋麗麗等[9]采用NIR光譜技術測定六味地黃丸中丹皮酚含量以及陳斌等[10]采用NIR光譜技術快速檢測六味地黃丸中水分、丹酚皮、馬錢苷含量。而本研究擬在六味地黃膠囊原質(zhì)量標準基礎上，新增馬錢苷、莫諾苷和芍藥苷等成分指標，采用AOTF-NIR光譜技術建立六味地黃膠囊中馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚、芍藥苷、熊果酸含量及水分6個指標的NIR定量模型，旨在實現(xiàn)六味地黃膠囊整體質(zhì)量的快速評價，為該產(chǎn)品質(zhì)量的全面控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate3000型高效液相色譜儀（美國Thermo公司）；Luminar-5030型ATOF-NIR光譜儀（美國Brimrose公司）；101A-2型電熱鼓風干燥箱（上海市儀器總廠）；ME204E型電子天平、AB135-S型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SB-1200D型超聲清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

近3年內(nèi)（2016-2018年）生產(chǎn)的六味地黃膠囊成品80批次，均由修正藥業(yè)集團股份有限公司提供（規(guī)格：每粒裝0.3 g，36粒/盒）；馬錢苷對照品（批號：111640-201606，純度：98.3%）、莫諾苷對照品（批號：111998-201602，純度：96.3%）、丹皮酚對照品（批號：110708-201407，純度：98.5%）、芍藥苷對照品（批號：110736-201640，純度：96.3%）、熊果酸對照品（批號：110742-201421，純度：93.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。80批次樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷、丹皮酚的含量測定

查閱相關文獻[11-12]，通過對供試品溶液制備方法及色譜條件優(yōu)化等試驗考察，最終確定最佳檢測方法，實現(xiàn)同步測定六味地黃膠囊中馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷、丹皮酚的含量。

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別取馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚、芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含馬錢苷200 μg、莫諾苷60 μg、芍藥苷20 μg、丹皮酚500 μg的混合對照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品內(nèi)容物2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：ACE C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：240 nm；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，5%→10%A；15～25 min，10%→20%A；25～35 min，20%→35%A；35～55 min，35%→75%A；55～60 min，75%→5%A；60～70 min，5%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。取“2.1.1”和“2.1.2”項下溶液，在此色譜條件下進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，各成分峰與相鄰峰間的分離度均大于1.5，以馬錢苷峰計理論板數(shù)為298 760、以莫諾苷峰計理論板數(shù)為42 741、以丹皮酚峰計理論板數(shù)為514 094、以芍藥苷峰計理論板數(shù)為191 317。色譜圖見圖1。

2.1.4 方法學考察 按相關方法操作進行方法學考察。結(jié)果，線性關系及定量限考察結(jié)果顯示，馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚和芍藥苷進樣量線性范圍分別為0.442 6～3.319 5（r=0.999 9）、0.118 2～0.886 5（r=0.999 3）、2.607 2～19.554（r=0.999 2）、0.051～0.382 5 μg（r=0.999 7），定量限分別為0.18、0.065、1.00、0.05 μg；精密度試驗結(jié)果顯示，馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.95%、0.79%、0.40%、1.54%（n=6），表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性考察試驗結(jié)果顯示，馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.78%、1.29%、0.30%、1.09%（n=7），表明供試品溶液在室溫[（25±5） ℃]條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定；重復性試驗結(jié)果顯示，馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚、芍藥苷含量的RSD分別為0.80%、085%、1.13%、1.72%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好；加樣回收率試驗結(jié)果顯示，馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚和芍藥苷的平均回收率分別為104.31%、99.40%、96.50%、95.97%（n=6），RSD分別為0.91%、1.18%、1.26%、1.82%（n=6），表明該方法準確、可行。

2.1.5 含量測定 分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖并計算含量，測定結(jié)果見表2。

2.2 熊果酸含量測定

查閱相關文獻[13-14]，通過供試品溶液制備及色譜條件優(yōu)化等試驗考察，確定最佳檢測方法，用以測定六味地黃膠囊中熊果酸含量。

2.2.1 對照品溶液的制備 取熊果酸對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL中含熊果酸60 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：ACE C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：215 nm；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液（89 ∶ 11，V/V），流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。取“2.2.1”和“2.2.2”項下溶液，在此色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，熊果酸色譜峰與相鄰峰間的分離度為71.5，理論板數(shù)為14 323。色譜圖見圖2。

2.2.4 方法學考察 按照相關方法操作進行方法學考察。結(jié)果，線性關系及定量限考察結(jié)果顯示，熊果酸進樣量線性范圍為0.119 6～1.196 μg（r=0.999 8），定量限為0.10 μg；精密度試驗結(jié)果顯示，熊果酸峰面積的RSD=1.26%（n=6），表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，熊果酸峰面積的RSD=0.85%（n=7），表明供試品溶液中熊果酸在室溫[（25±5） ℃]條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定；重復性試驗結(jié)果顯示，熊果酸含量的RSD=1.24%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好；加樣回收率考察試驗結(jié)果顯示，熊果酸的平均回收率為99.77%，RSD=1.28%（n=6），表明該方法準確、可行。

2.2.5 含量測定 分別精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液與“2.2.2”項下供試品溶液各10 μL，注入色譜儀，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖并計算含量，結(jié)果詳見表2。

2.3 水分含量測定

取供試品內(nèi)容物適量，按2015年版《中國藥典》（四部）通則0832水分測定法中第二法烘干法[15]進行六味地黃膠囊水分含量測定，結(jié)果詳見表2。

2.4 NIR原始光譜采集與預處理

取六味地黃膠囊內(nèi)容物，置于樣品采集槽中，掃描波長為1 100～2 300 nm，波長增量為2.0 nm，波長平均次數(shù)為300，每批次樣品掃描3次，取平均值作為該樣品的原始吸收光譜圖，六味地黃膠囊的NIR原始吸收光譜圖見圖3。

在建立模型前，需要消除噪音和基線漂移等因素對光譜采集的影響。故先采用一階導數(shù)9點平滑法（Savitzky-Golay）[16-17]對NIR原始光譜進行預處理，以消除顏色差別等因素引起的光譜基線偏移和漂移，六味地黃膠囊NIR預處理光譜圖見4。

2.5 NIR定量模型的建立

2.5.1 校正集與驗證集樣本的選取 按照馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚、芍藥苷、熊果酸、水分指標含量高低，均勻選取70批樣本組成校正集樣品，用于建立NIR定量模型；其余10批樣本為驗證集樣品，用于對模型進行外部驗證。校正集與驗證集樣本含量分布范圍見表3。

2.5.2 各指標定量模型的建立 利用Unscrambler定量分析軟件，將六味地黃膠囊上述6個指標測定結(jié)果與預處理后的NIR光譜相結(jié)合，分別以偏最小二乘法（PLS）和交叉-驗證法（Cross-validation）建立各指標的定量模型[3]。采用光譜影響值Leverage和化學值誤差Residual等統(tǒng)計量檢驗，剔除NIR光譜與各指標測定結(jié)果的異常值，并根據(jù)模型主要參數(shù)：內(nèi)、外部驗證相關系數(shù)（R2）、校正標準偏差（RMSEC）、預測標準偏差（RMSEP）等進行篩選優(yōu)化，確定各指標NIR檢測定量模型。其中，R2越接近1，NIR模型預測值與實測值相關性越好；RMSEC與RMSEP越接近，且RMSEC小于RMSEP，表示所建模型適用性越強，預測效果越好。6個指標的NIR定量模型模型圖見圖5（圖中橫坐標為實測值，縱坐標為預測值），參數(shù)統(tǒng)計結(jié)果見表4。

上述結(jié)果表明，參與建模的六味地黃膠囊樣品中6個指標含量與其NIR光譜的相關性較好，所建立的NIR檢測模型預測性能良好。

2.6 NIR定量模型的驗證

利用各指標的NIR定量模型，對未參與建模的10批次驗證集樣品進行分析。參考“2.5.2”NIR光譜采集與處理方法獲取10批樣品的光譜數(shù)據(jù)，將光譜數(shù)據(jù)導入The Unscramber分析軟件，調(diào)用已建立的NIR定量模型對外部樣品進行分析，即得預測值。計算預測值與實測值的偏差[偏差（%）=（實測值-預測值）/實測值×100%]，驗證所建定量模型的準確性。各指標的驗證結(jié)果見表5。

由以上結(jié)果可知，10批次驗證集樣品中馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚、芍藥苷的預測值與HPLC實測值的平均偏差分別為6.04%、6.05%、5.87%、6.97%、5.62%，均小于10%；水分的預測值與實測值分別平均偏差為4.83%，小于5%。由此可見，各指標NIR檢測模型預測值與常規(guī)檢測方法測定值之間相關性良好，測定準確性較高，可以采用NIR光譜模型快速檢測、分析六味地黃膠囊成品制劑中的馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚、芍藥苷、熊果酸、水分的含量。

3 討論

本研究前期提升了熊果酸含量檢測的薄層色譜掃描法為高效液相色譜法，同時建立了馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚、芍藥苷同步含量測定方法，其中馬錢苷、莫諾苷歸屬于酒萸肉，并且酒萸肉標準中以這兩個指標為含量測定項；芍藥苷、丹皮酚歸屬于牡丹皮，牡丹皮標準中以酚類成分丹皮酚為含量測定項，據(jù)文獻報道牡丹皮中單萜類化物具有滋肝陰補脾陰（保肝、增強免疫力）的功效[18]。酒萸肉與牡丹皮在六味地黃膠囊處方中為主要藥味，用量較大、有效成分含量高，故選定檢測指標分別為馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚和芍藥苷。以上建立的含量檢測方法簡便、準確、重復性好，可用于測定六味地黃膠囊中6個指標成分的含量，獲取含量數(shù)據(jù)。接著，筆者采用AOTF-NIR光譜技術分別建立了六味地黃膠囊中馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚、芍藥苷、熊果酸、水分指標的NIR光譜定量模型，實現(xiàn)了6個指標同步快速檢測，整體表征產(chǎn)品質(zhì)量，且建立的定量模型預測準確性較高、分析速度快，該方法的建立完善了六味地黃膠囊質(zhì)量快速檢測體系，為藥品生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了可靠、便捷的檢測方法。

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（收稿日期：2018-11-23 修回日期：2019-02-28）

（編輯：林 靜）