王壽權(quán)，于宗義，員冬玲，柴本銀，尹鳳交，史勇春

1(山東天力能源股份有限公司，山東 濟(jì)南，250103) 2(山東省干燥過程節(jié)能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南，250103) 3(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省科學(xué)院能源研究所，山東 濟(jì)南，250103)

生物發(fā)酵是高能耗產(chǎn)業(yè)[1-2]，在工業(yè)生產(chǎn)中，加壓蒸汽高溫滅菌是發(fā)酵液滅菌的主要方式[3-4]，節(jié)約發(fā)酵液滅菌的蒸汽消耗，將對(duì)整個(gè)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的節(jié)能減排起到積極作用[5]。臭氧具有強(qiáng)氧化性，對(duì)細(xì)菌有極強(qiáng)的氧化作用，可以破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[6]，因此廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境和水的消毒[7-8]。但是國內(nèi)外對(duì)臭氧用于發(fā)酵液的滅菌研究較少，一方面因?yàn)槌粞蹙哂袕?qiáng)氧化性，對(duì)培養(yǎng)基有機(jī)物有較大的破壞作用[9-10]，影響發(fā)酵效率，另一方面，臭氧在發(fā)酵液里的殘留會(huì)影響發(fā)酵的順利進(jìn)行[11]。考慮以上兩方面因素，本文研究采用蒸汽滅菌培養(yǎng)基有機(jī)物，臭氧滅菌發(fā)酵液中50%的水，分別滅菌后混合，最終實(shí)現(xiàn)節(jié)約發(fā)酵液滅菌蒸汽的目的。用臭氧滅菌后的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵多糖試驗(yàn)，并進(jìn)行了10 m3發(fā)酵罐的中試試驗(yàn)驗(yàn)證。最后，計(jì)算了該工藝節(jié)約的蒸汽量和冷卻水用量，為該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

產(chǎn)多糖菌種：為自主篩選的芽孢桿菌，現(xiàn)保存于山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10、蛋白胨 5、NaCl 2、酵母膏 1，pH自然；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 35、豆粕粉 6、CaCO32，pH 7.5～8.0。

1.2 儀器與設(shè)備

XM-K-G50臭氧發(fā)生器，南京鑫盟環(huán)保科技有限公司、DOZ7600臭氧濃度檢測(cè)儀檢測(cè)限(0～10.00 mg/L)，精度(±0.01 mg/L)，上海諾博環(huán)?？萍加邢薰?。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基滅菌方法

搖瓶滅菌：按配方配制好培養(yǎng)基，采用臭氧滅菌水發(fā)酵搖瓶，加水量減半，在蒸汽滅菌鍋中120 ℃滅菌30 min；

發(fā)酵罐滅菌：按配方配制好培養(yǎng)基，采用臭氧滅菌水的發(fā)酵罐，加水量減半，采用夾套通蒸汽加熱到90 ℃，再直接向罐中通入蒸汽，加熱到120 ℃，維持30 min。

1.3.2 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：接種1環(huán)斜面種子到種子培養(yǎng)基，搖床(30±2)℃、180 r/min培養(yǎng)20 h；

搖瓶培養(yǎng)：向滅菌完的培養(yǎng)基中接種種子培養(yǎng)液，接種量10%，接種后(30±2)℃、220 r/min培養(yǎng)66 h；發(fā)酵罐培養(yǎng)：向滅菌完的培養(yǎng)基中接種種子培養(yǎng)液，接種量10%，接種后(30±2)℃、通風(fēng)比0.6、攪拌速度220 r/min培養(yǎng)66 h；

1.3.3 檢測(cè)方法

臭氧濃度檢測(cè)：采用臭氧濃度檢測(cè)儀檢測(cè)水中臭氧濃度；自來水中菌落總數(shù)檢測(cè)：參照GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于生活飲用水中菌落總數(shù)檢測(cè)方法[12]；葡萄糖含量測(cè)定：參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測(cè)定》中直接滴定法測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖含量[13]。

1.3.4 多糖得率測(cè)定

稱取一定量的多糖發(fā)酵液，加入1.5倍體積的95%(體積分?jǐn)?shù))的酒精，充分混合，在4℃放置過夜，使得多糖沉淀，濾出沉淀，再用95%(體積分?jǐn)?shù))的酒精洗滌沉淀2次。烘干沉淀，得到多糖樣品的質(zhì)量。多糖提取得率計(jì)算如公式(1)：

(1)

1.3.5 臭氧水制備方法

1.3.5.1 實(shí)驗(yàn)條件臭氧水制備

實(shí)驗(yàn)臭氧水的制備是直接向自來水中通入臭氧氣體，通氣時(shí)氣體經(jīng)過一個(gè)曝氣頭曝氣，這樣有利于臭氧更好的溶解[14]，當(dāng)水中臭氧濃度達(dá)到要求濃度值時(shí)，調(diào)節(jié)臭氧流量，將臭氧在水中質(zhì)量濃度維持在(設(shè)定目標(biāo)值±0.2)mg/L。

1.3.5.2 中試條件臭氧水制備

中試時(shí)制備臭氧水的流程如圖1所示，來自發(fā)酵車間的無菌空氣經(jīng)過臭氧發(fā)生器后轉(zhuǎn)變?yōu)楹粞鯕怏w，再經(jīng)過氣液混合器與自來水混合變?yōu)槌粞跛?，再進(jìn)入到臭氧水罐，當(dāng)臭氧水罐滿時(shí)，關(guān)閉自來水，打開罐底閥門，進(jìn)行循環(huán)，待罐中水的臭氧質(zhì)量濃度達(dá)到(5±0.2) mg/L時(shí)，繼續(xù)循環(huán)滅菌40 min。

圖1 中試制備臭氧水流程圖Fig.1 Flowchart of ozone water preparation in pilot production

1.3.6 臭氧滅菌水用于發(fā)酵液方法

按照發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，配制2倍濃度的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值到8.5，采用蒸汽滅菌，滅菌結(jié)束后將預(yù)先使用臭氧滅菌好的臭氧水按照1∶1的體積比趁熱加入到培養(yǎng)基中，加入的過程是在無菌的條件下進(jìn)行。

1.4 發(fā)酵罐蒸汽耗量及冷卻水量計(jì)算

1.4.1 培養(yǎng)基比熱

對(duì)照培養(yǎng)基含固量w=4.3%，采用臭氧滅菌50%的水，剩余需要實(shí)罐消毒的發(fā)酵液培養(yǎng)基含固量為8.6%，固形物比熱[15]C0=1.55 kJ/(kg·℃)，水的比熱Cs=4.2 kJ/(kg·℃)。

則對(duì)照培養(yǎng)基比熱：C=C0×w+Cs(1-w)=1.55×4.3%+4.2×95.7%=4.09 kJ/(kg·℃)。

臭氧培養(yǎng)基比熱：C=C0×w+Cs(1-w)=1.55×8.6%+4.2×91.4%=3.97 kJ/(kg·℃)。

1.4.2 間接換熱蒸汽耗量S1

蒸汽間接升溫發(fā)酵液所耗蒸汽量如公式(2)：

(2)

式中：S1，間接升溫蒸汽用量，kg；G，培養(yǎng)基質(zhì)量，kg；C，培養(yǎng)基比熱，kJ/(kg·℃)；t2，間接加熱結(jié)束時(shí)培養(yǎng)基溫度，℃；t1，培養(yǎng)基初始溫度，℃；r，蒸汽汽化潛熱，kJ/kg；f，熱損失率,%；

1.4.3 直接蒸汽加熱蒸汽耗量S2

蒸汽直接升溫發(fā)酵液所耗蒸汽量如公式(3)：

(3)

式中：S2，直接升溫蒸汽用量，kg；t3，培養(yǎng)基滅菌所需溫度，℃；I，蒸汽的焓值，kJ/kg；CS，水的比熱，kJ/(kg·℃)。

1.4.4 發(fā)酵罐保溫階段蒸汽耗量S3

保溫階段蒸汽耗量與發(fā)酵罐設(shè)計(jì)有關(guān)，也與工人的操作習(xí)慣有關(guān)，這部分蒸汽耗量很難準(zhǔn)確計(jì)算，一般根據(jù)經(jīng)驗(yàn)估算[16],如公式(4)：

S3=(30%～50%)×S2

(4)

式中：一般發(fā)酵罐容量<5 m3，取50%；發(fā)酵罐容量>5 m3，取30%。

1.4.5 發(fā)酵滅菌總蒸汽耗量S

發(fā)酵罐實(shí)罐滅菌總蒸汽耗量計(jì)算如公式(5)：

S=S1+S2+S3

(5)

1.4.6 冷卻水耗量M

降溫?zé)崃亢屠鋮s水量計(jì)算如公式(6)、公式(7)：

Q=G×C×(t4-t5)

(6)

(7)

式中：Q，降溫?zé)崃?，kJ；M，冷卻水耗量，kg；t4，開始通冷卻水時(shí)發(fā)酵液溫度，℃；t5，停止通冷卻水時(shí)發(fā)酵液溫度，℃；t6，冷卻水排水溫度，℃；t7，冷卻水初始溫度，℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧濃度與維持時(shí)間對(duì)滅菌效果的影響

研究了不同臭氧濃度下1 mL自來水中菌落情況，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)臭氧質(zhì)量濃度為3、4、5 mg/L時(shí)，自來水達(dá)到無菌狀態(tài)所需要的時(shí)間分別為120、60和40 min。但是當(dāng)臭氧質(zhì)量濃度低于2 mg/L時(shí)，臭氧作用時(shí)間3 h仍不能保證每個(gè)批次處理的自來水都檢不出菌落，達(dá)不到可以在發(fā)酵工業(yè)化應(yīng)用的穩(wěn)定的無菌狀態(tài)。從圖中可以看出，臭氧濃度越高，自來水達(dá)到無菌狀態(tài)所需時(shí)間越短。從工業(yè)應(yīng)用價(jià)值與效率來說，選用臭氧4 mg/L以上的質(zhì)量濃度滅菌自來水具有可行性。

圖2 不同濃度臭氧水中菌落數(shù)量隨時(shí)間變化情況Fig.2 Changes of the amount of colonies in different ozone concentrations with time

2.2 發(fā)酵應(yīng)用條件下臭氧的殘留

臭氧在水中具有自分解特性[17-18]，其分解速率隨溫度和pH值的升高而加快[19-20]。本文實(shí)驗(yàn)?zāi)M發(fā)酵生產(chǎn)過程中發(fā)酵液的pH和溫度條件，對(duì)100 ℃熱水和剛滅菌完100 ℃發(fā)酵液按照體積比1∶1加入5 mg/L 臭氧水，混勻后溫度降到(60±5)℃，pH降到8.0，此時(shí)測(cè)定混合液中臭氧濃度。結(jié)果顯示，臭氧滅菌水與100 ℃熱水混合樣及發(fā)酵液混合樣，都未檢測(cè)到臭氧殘留。這可能是在60 ℃、pH 8.0條件下，臭氧分解速度極快，在檢測(cè)過程中就已經(jīng)分解。根據(jù)張暉等[21]研究的臭氧在水中自分解的動(dòng)力學(xué)方程，在pH 8.0，60 ℃的條件下，5 mg/L 的臭氧水，完全分解僅需要0.53 s，因此，在實(shí)驗(yàn)條件下未能檢測(cè)到發(fā)酵液中臭氧殘留,符合張暉等的研究結(jié)果。綜合以上研究結(jié)果，臭氧在發(fā)酵應(yīng)用條件下，殘留時(shí)間極短，對(duì)發(fā)酵液的影響較小，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

2.3 臭氧滅菌后發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

2.3.1 臭氧滅菌水用于搖瓶發(fā)酵對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

臭氧滅菌水配制搖瓶培養(yǎng)基發(fā)酵，結(jié)果如表1所示。從表中可以看出，采用臭氧滅菌后的發(fā)酵液發(fā)酵，多糖提取得率與對(duì)照組相當(dāng)，這說明，采用50%的臭氧水作培養(yǎng)基發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵水平?jīng)]有影響。對(duì)發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液進(jìn)行鏡檢，對(duì)照組和臭氧實(shí)驗(yàn)組都未檢測(cè)出雜菌，這說明臭氧滅菌自來水的效果較佳，符合發(fā)酵的無菌要求。從搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，臭氧滅菌發(fā)酵液可以應(yīng)用于該多糖的發(fā)酵。

表1 多糖搖瓶發(fā)酵情況(n=3)Table 1 Fermentation of polysaccharide in shake flask

注：“-”表示發(fā)酵結(jié)束后，鏡檢未染雜菌。

2.3.2 臭氧滅菌水用于10 m3發(fā)酵罐對(duì)發(fā)酵的影響

將使用臭氧滅菌完的3.5 m3自來水用無菌壓縮空氣壓入到剛蒸汽滅菌完的培養(yǎng)基中，混勻后發(fā)酵液溫度降到60℃，檢測(cè)培養(yǎng)基中臭氧的殘留濃度，結(jié)果未檢測(cè)到殘留臭氧。發(fā)酵液繼續(xù)降溫到(30±2)℃，按培養(yǎng)基體積的10%接種種子液，220 r/min攪拌，通風(fēng)比0.6的條件下發(fā)酵66 h過程中取樣并分析參數(shù)指標(biāo)，結(jié)果如表2和圖3所示。

表2 10 m3發(fā)酵罐發(fā)酵過程中染菌情況Table 2 Microbiological contamination during fermentation in 10 m3 fermentation tanks

注：“-”表示發(fā)酵液鏡檢未染雜菌。

圖3 10 m3發(fā)酵罐中使用臭氧水發(fā)酵多糖的影響Fig.3 Effect of ozone water on polysaccharide fermentation in 10 m3 fermentation tank

臭氧實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組從發(fā)酵開始到發(fā)酵結(jié)束都未發(fā)現(xiàn)有雜菌，這說明采用臭氧滅菌發(fā)酵液對(duì)微生物的滅菌效果能夠達(dá)到傳統(tǒng)蒸汽滅菌效果。此外，與對(duì)照試驗(yàn)罐相比，采用臭氧滅菌的發(fā)酵液，碳源葡萄糖的變化趨勢(shì)與對(duì)照罐的變化趨勢(shì)一致，多糖的生成與對(duì)照罐相比變化趨勢(shì)相同，試驗(yàn)罐與對(duì)照罐數(shù)值的微小差別應(yīng)該是不同批次發(fā)酵過程中的正常差異。從10 m3發(fā)酵罐發(fā)酵多糖中試的結(jié)果來看，采用臭氧滅菌發(fā)酵液，對(duì)發(fā)酵過程與發(fā)酵結(jié)果都沒有影響，利用臭氧滅菌部分發(fā)酵液的方案經(jīng)驗(yàn)證可行。

2.4 10 m3發(fā)酵罐采用臭氧滅菌發(fā)酵液節(jié)約蒸汽和冷卻水計(jì)算

2.4.1 滅菌蒸汽耗量計(jì)算

10 m3發(fā)酵罐裝發(fā)酵液量為7 m3，蒸汽滅菌采用實(shí)罐滅菌，滅菌使用蒸汽壓力為表壓0.2 MPa，臭氧水罐培養(yǎng)基50%水采用臭氧滅菌，其余采用蒸汽實(shí)罐滅菌。實(shí)罐滅菌分為3個(gè)階段：間接換熱升溫(20～90 ℃)、直接蒸汽加熱(90～120 ℃)、120 ℃保溫維持。下面為各個(gè)階段消耗蒸汽計(jì)算：

(1)間接換熱升溫蒸汽耗量

培養(yǎng)基密度取1 070 kg/m3，熱損失率一般取5%～15%[9]，本文計(jì)算取10%。按照公式(2)計(jì)算結(jié)果如下。

對(duì)照罐蒸汽耗量：S1=7×1 070×4.09×(90-20)×(1+0.1)/2 165=1 089.5 kg；

臭氧罐蒸汽耗量：S1’=3.5×1 070×3.97×(90-20)×(1+0.1)/2 165=528.7 kg。

(2)直接蒸汽加熱蒸汽耗量

按照公式(3)計(jì)算直接加熱蒸汽耗量，結(jié)果如下。

對(duì)照罐蒸汽耗量：S2=7×1 070×4.09×(120-90)×(1+0.1)/(2 726-120×4.2)=455.0 kg；

臭氧罐蒸汽耗量：S2’=3.5×1 070×3.97×(120-90)×(1+0.1)/(2 726-120×4.2)=220.8 kg。

(3)發(fā)酵罐保溫維持階段蒸汽耗量

采用10 m3發(fā)酵罐滅菌，按照公式(4)，經(jīng)驗(yàn)系數(shù)取30%，由于對(duì)照和臭氧水罐都是在10 m3發(fā)酵罐滅菌，在維持階段對(duì)照罐與臭氧消毒罐消耗的蒸汽相當(dāng)，以經(jīng)驗(yàn)值估算S3=30%×S2=136.5 kg。

(4)發(fā)酵罐滅菌總耗蒸汽量

按照公式(5)計(jì)算發(fā)酵液滅菌總蒸汽耗量，結(jié)果如下。

對(duì)照罐蒸汽總耗量：S=S1+S2+S3=1 681.0 kg;

臭氧罐蒸汽總耗量：S’=S1’+S2’+S3=8 8 6.0 kg。

從10 m3發(fā)酵罐滅菌蒸汽耗量來看，采用臭氧滅菌50%的水，與實(shí)罐滅菌相比，每罐發(fā)酵液滅菌可以節(jié)約0.2 MPa的蒸汽795 kg，整個(gè)發(fā)酵液滅菌節(jié)約蒸汽比例達(dá)到47.3%。

2.4.2 冷卻水耗量計(jì)算

在生產(chǎn)中，發(fā)酵液降溫通常在通風(fēng)情況下自然降到100 ℃，然后通入冷卻水降溫，本文實(shí)驗(yàn)采用臭氧滅菌后的自來水，直接通入降溫到100 ℃的發(fā)酵液中，最終混合后，培養(yǎng)基溫度能夠迅速降到60 ℃，可以減少從100 ℃降溫到60 ℃的冷卻水使用，按照公式(6)、(7)，減少冷卻水量計(jì)算如下：

降溫?zé)崃縌=7×1 070×4.09×(100-60)=1 225 364 kJ；

冷卻水初始溫度取20 ℃，在發(fā)酵液100 ℃到60 ℃降溫段，降溫水平均排水溫度約70 ℃，則減少冷卻水用量為：

根據(jù)以上計(jì)算，10 m3發(fā)酵罐培養(yǎng)基降溫，采用臭氧滅菌50%的水加入到發(fā)酵罐中，每罐可以減少5 835 kg 冷卻水的使用。

3 結(jié)論

本文研究了臭氧滅菌水用于發(fā)酵液發(fā)酵，當(dāng)臭氧質(zhì)量濃度為3、4、5 mg/L時(shí)，達(dá)到無菌狀態(tài)所需要的時(shí)間分別為120、60和40 min。在pH 8.0、60 ℃下,臭氧在水中分解極快，檢測(cè)不到發(fā)酵液中臭氧殘留，符合水中臭氧自分解動(dòng)力學(xué)方程。臭氧滅菌好的發(fā)酵液發(fā)酵結(jié)果顯示，沒有不利影響。10 m3發(fā)酵罐滅菌的蒸汽耗量可以節(jié)約47.3%，每罐可以減少5 835 kg冷卻水的使用。

本文通過對(duì)臭氧滅菌水用于發(fā)酵研究，發(fā)現(xiàn)臭氧滅菌水對(duì)發(fā)酵未產(chǎn)生不利影響，同時(shí)可以大幅度節(jié)約滅菌蒸汽和減少冷卻水用量。但本文只研究了多糖發(fā)酵的影響，對(duì)其他發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用沒有進(jìn)一步研究，還需要更多的研究結(jié)果來驗(yàn)證這項(xiàng)技術(shù)在行業(yè)中的應(yīng)用效果。