葛蕓，湯斌，李松

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)

目前，常見(jiàn)治療心血管疾病的靜脈溶栓藥物有鏈激酶(streptokinase，SK)、尿激酶(urokinase，UK)和組織纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen aetivator，t-PA)等[1]，然而，這些溶栓藥物在靜脈中保持藥效時(shí)間短，存在出血性并發(fā)癥等風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。納豆激酶(nattokinase，NK)是由日本科學(xué)家SUMI等在傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆中發(fā)現(xiàn)的一種具有溶解血栓功能的絲氨酸蛋白酶[3-4]。與上述常見(jiàn)的溶栓劑相比，納豆激酶不僅可以直接水解交聯(lián)狀態(tài)的纖維蛋白，還能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生t-PA，將人體內(nèi)的尿激酶原激活為尿激酶，進(jìn)一步促進(jìn)血栓溶解[5-6]，具有活性高、安全性高、成本低、口服方便等優(yōu)點(diǎn)，存在巨大的應(yīng)用潛力[7-8]。納豆激酶的生產(chǎn)方式主要有固態(tài)發(fā)酵法[9]和液態(tài)發(fā)酵法[10]，如張杰等[11]利用固態(tài)發(fā)酵法獲得納豆激酶的產(chǎn)量為4 087.83 U/g；KWON等[12]在5 L發(fā)酵罐中采用pH-stat補(bǔ)料的方式獲得納豆激酶的產(chǎn)量為14 500 U/mL，是目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高發(fā)酵水平。董艷山等[13]利用枯草芽孢桿菌在7 L發(fā)酵罐通過(guò)分批發(fā)酵的方式獲得最高發(fā)酵水平是6 717 U/mL。與固態(tài)發(fā)酵相比，液態(tài)發(fā)酵更適合于納豆激酶的發(fā)酵過(guò)程控制和放大生產(chǎn)。因此，研究納豆激酶的液態(tài)發(fā)酵控制工藝對(duì)提高納豆激酶的表達(dá)量及其產(chǎn)品試制具有重要的研究意義。

納豆激酶活性的檢測(cè)主要利用纖維蛋白平板法，也是國(guó)家衛(wèi)生部認(rèn)定為尿激酶和蚓激酶等纖溶酶活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法[14]，其原理是通過(guò)纖溶酶降解凝血酶激活纖維蛋白原形成的纖維蛋白而產(chǎn)生透明圈，并以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)計(jì)算得到相應(yīng)的纖溶酶活力[15]。目前，納豆激酶主要生產(chǎn)菌為納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)，為枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種，而枯草芽孢桿菌所產(chǎn)纖溶酶除了納豆激酶外，可能還含有其他纖溶酶，例如與納豆激酶蛋白質(zhì)序列相似度高達(dá)97.63%、但在理化性質(zhì)上卻存在較大差異的纖溶酶BSF1[16]。因此，在利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶時(shí)，上述具有納豆激酶相似活性纖溶酶的存在，可能會(huì)對(duì)納豆激酶活性的精確測(cè)定帶來(lái)較大的影響。為此，本文在利用放大發(fā)酵工藝控制提高納豆激酶表達(dá)量的同時(shí)，構(gòu)建了納豆激酶基因突變菌株，通過(guò)反向驗(yàn)證法分析了納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中纖溶酶組分，為納豆激酶活力測(cè)定的準(zhǔn)確性和真實(shí)性提供了有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

納豆芽孢桿菌TN-02由本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.1.2 主要試劑

牛血纖維蛋白原(100 mg/支)、凝血酶(1 000 U/瓶),購(gòu)于Sigma公司；尿激酶(1 240 IU/瓶),購(gòu)于國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)；TaqDNA聚合酶、T4連接酶和質(zhì)粒pMD19-T(Simple),購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；卡那霉素,購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；豆粕,購(gòu)于蕪湖市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；復(fù)配豆制品消泡劑,購(gòu)于江蘇常州市食品添加劑有限公司；其他試劑,均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉5。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉5，甘油5。

放大發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：甘油30，豆粕粉12.5，Na2HPO4·12H2O 4，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.6，CaCl20.1，蛋氨酸0.2，色氨酸0.1，苯丙氨酸0.1， 酪氨酸0.1。

1.1.4 儀器與設(shè)備

TC312 PCR儀，美國(guó)TECH公司；BIOTECH-10JSA 10 L全自動(dòng)發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；QHZ-123B組合式搖床，江蘇省太倉(cāng)市華美生化儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備

用接種環(huán)從固體培養(yǎng)物中挑取1環(huán)納豆芽孢桿菌TN-02接種于含有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于37 ℃、200 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)12 h， 制得一級(jí)種子液。取1 mL一級(jí)種子液接種于含有300 mL種子培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)14 h，制得二級(jí)種子液。

1.2.2 10 L發(fā)酵罐放大發(fā)酵控制

依據(jù)搖瓶發(fā)酵優(yōu)化所得培養(yǎng)基組成作為發(fā)酵罐放大基礎(chǔ)培養(yǎng)基(見(jiàn)1.1.3)。將上述二級(jí)種子液(OD600=3.9)按接種量5%接種于10 L發(fā)酵罐中，裝液量6 L。發(fā)酵初始條件：通氣量1.5 vvm，罐內(nèi)壓力0.05 MPa，轉(zhuǎn)速300 r/mim，利用氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%)調(diào)節(jié)pH值為7.0。發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通氣量和罐壓將發(fā)酵液溶氧濃度(DO)控制在30%左右，同時(shí)依據(jù)發(fā)酵進(jìn)程調(diào)整溫度和補(bǔ)料控制條件。

溫度對(duì)納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響：分別將發(fā)酵罐內(nèi)溫度控制在30、33、35和37 ℃進(jìn)行分批發(fā)酵，以研究培養(yǎng)溫度對(duì)納豆激酶表達(dá)水平的影響。

流加甘油對(duì)納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響：在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)流加甘油(質(zhì)量濃度100 g/L)使其終濃度維持在15 g/L左右，研究甘油補(bǔ)料發(fā)酵對(duì)納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響。

流加胰蛋白胨對(duì)納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響：由于發(fā)酵液中胰蛋白胨無(wú)法精確測(cè)定，在發(fā)酵過(guò)程中分別以0.3、0.5、0.7、1.0 g/(h·L)的速度流加胰蛋白胨，確定發(fā)酵時(shí)流加胰蛋白胨對(duì)納豆激酶表達(dá)量的影響。

1.2.3 納豆激酶活力測(cè)定的方法

根據(jù)ASTRUP等[17]方法制作纖維蛋白平板，將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，每種濃度吸取10 μL點(diǎn)樣于纖維蛋白平板上，于37 ℃恒溫箱中保溫18 h。測(cè)定不同透明圈的垂直直徑，以垂直直徑乘積(A)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品濃度(C)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線(線性回歸方程為：lnA=0.365lnC+4.158 9，R2=0.996 4)。

納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵液于8 000 r/min條件下離心2 min，將上清液稀釋一定倍數(shù)后，取10 μL點(diǎn)于纖維蛋白平板上，37 ℃培養(yǎng)箱中保溫18 h，測(cè)量透明圈的垂直直徑，并根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算納豆激酶活力。

1.2.4 甘油的測(cè)定方法

甘油濃度測(cè)定采用滴定法[18]進(jìn)行。

1.2.5 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank已報(bào)道的納豆激酶基因序列進(jìn)行納豆芽孢桿菌TN-02納豆激酶基因aprN引物設(shè)計(jì)，根據(jù)質(zhì)粒pPIC9K中所含卡那霉素抗性基因kan的序列信息設(shè)計(jì)引物。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，具體序列見(jiàn)表1。

表1 本文中所用引物Table 1 Primers used in this study

注：劃線部分為酶切位點(diǎn)。

1.2.6 納豆激酶基因缺失重組菌的構(gòu)建

納豆芽孢桿菌TN-02中納豆激酶基因失活采用同源重組的方法[19-20]。以納豆芽孢桿菌TN-02基因組DNA為模板，利用引物NK-F和NK-R擴(kuò)增得到aprN序列，其大小為1 473 bp，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與質(zhì)粒pMD19T相連接，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pMD19T-aprN。測(cè)序結(jié)果表明，在aprN序列的第403位和第1 160位堿基處分別有NotⅠ和NcoⅠ的單酶切位點(diǎn)。因此，研究中通過(guò)將kan序列替換重組質(zhì)粒pMD19T-aprN中NotⅠ和NcoⅠ位點(diǎn)之間的aprN序列(749 bp)，從而構(gòu)建得到含有以aprN上游序列(410 bp)為上同源臂，kan基因序列(816bp)和aprN下游序列(314bp)為下同源臂的重組質(zhì)粒PMD19T-aprNΔkan，其構(gòu)建過(guò)程如圖1所示。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化[21]進(jìn)入納豆芽孢桿菌TN-02中，利用重組質(zhì)粒攜帶的aprN序列兩端同源臂進(jìn)行同源重組，并使用含有15 μg/mL卡那霉素平板篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。以陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，利用引物NK-F和NK-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證aprN△kan序列是否與原始aprN序列產(chǎn)生了正確的同源交換和重組。

圖1 重組質(zhì)粒pMD19T-aprN△kan的構(gòu)建Fig.1 Cloning strategy of recombinant plasmids pMD19T-aprN△kan

1.2.7 重組菌的生長(zhǎng)及纖溶酶活性的測(cè)定

將重組菌和原始菌分別接種于20 mL (50 mL三角瓶)LB培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min條件下活化12 h。取100 μL活化種子液接種于100 mL(250 mL三角瓶)LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)，期間每隔2 h取樣1次測(cè)定菌體濃度，繪制生長(zhǎng)曲線。同時(shí)，取1 mL上述活化種子液接種于50 mL(250 mL三角瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h后測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中纖溶酶活力，并進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)納豆激酶發(fā)酵活力的影響

當(dāng)溫度控制在30～35 ℃時(shí)，雖然培養(yǎng)溫度越高，所獲得的菌體生長(zhǎng)速度越快且達(dá)到最大酶活所需時(shí)間越短，但是菌體的迅速生長(zhǎng)導(dǎo)致產(chǎn)生大量泡沫，不利于發(fā)酵控制和產(chǎn)酶期的穩(wěn)定。例如，將控制溫度進(jìn)一步提升至37 ℃時(shí)，產(chǎn)酶水平及酶的穩(wěn)定性開(kāi)始下降(圖2-a)。實(shí)驗(yàn)中，分別嘗試了聚醚類，有機(jī)硅類和高碳醇脂肪酸酯類等多種消泡劑對(duì)泡沫進(jìn)行控制，均無(wú)法達(dá)到理想的消泡效果。因此研究中進(jìn)一步采用了變溫發(fā)酵方式，以期獲得細(xì)胞生長(zhǎng)和泡沫產(chǎn)生之間的平衡。具體變溫控制工藝為：在0～12 h采用30 ℃ 培養(yǎng)菌體，降低菌體生長(zhǎng)速率(控制泡沫產(chǎn)生)，在12 h后將溫度分別調(diào)整至為33、35和37 ℃，以獲得菌體在短時(shí)間內(nèi)的快速生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成。結(jié)果表明，當(dāng)后期溫度調(diào)整為35 ℃時(shí)，總發(fā)酵時(shí)間達(dá)到18 h時(shí)納豆激酶活力最大，為9 865.7 U/mL，比 35 ℃恒溫發(fā)酵提高了18.5%，如圖2-b所示。

a-恒溫發(fā)酵;b-變溫發(fā)酵圖2 發(fā)酵溫度對(duì)納豆芽孢桿菌TN-02產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the production of nattokinase by Bacillus natto TN-02

2.2 甘油補(bǔ)料發(fā)酵

采用上述變溫發(fā)酵控制工藝，在發(fā)酵至第12 h，將發(fā)酵溫度調(diào)整為35 ℃并開(kāi)始流加甘油，使甘油終質(zhì)量濃度維持在15 g/L左右。結(jié)果顯示，通過(guò)流加甘油工藝獲得的平均產(chǎn)酶水平明顯高于對(duì)照組，產(chǎn)酶時(shí)間亦得到了延長(zhǎng)(2 h)，最終在第20 h，納豆激酶發(fā)酵活力達(dá)到最高，為12 285.6 U/mL，相比對(duì)照組所得最高活力提高了23.2%，如圖3所示。

2.3 胰蛋白胨補(bǔ)料發(fā)酵

在甘油補(bǔ)料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，當(dāng)發(fā)酵溫度調(diào)整為35 ℃ 時(shí)，開(kāi)始分別以0.3、0.5、0.7、1.0 g/(h·L)的速度補(bǔ)加胰蛋白胨。結(jié)果表明，胰蛋白胨流加速度為0.5 g/(h·L)時(shí)，納豆激酶的表達(dá)量明顯高于其他流加速度下的表達(dá)量，在第20 h獲得的納豆激酶酶活峰值為13 978.3 U/mL，比單一甘油補(bǔ)料發(fā)酵提高了13.7%，如圖4所示。

圖3 流加甘油對(duì)納豆芽孢桿菌TN-02產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.3 Effect of feeding glycerol on the production of nattokinase by Bacillus natto TN-02

圖4 流加胰蛋白胨對(duì)納豆芽孢桿菌TN-02產(chǎn)納豆激酶活力的影響Fig.4 Effect of feeding tryptone on the production of nattokinase by Bacillus natto TN-02

2.4 納豆激酶基因缺失重組菌的構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果表明納豆芽孢桿菌TN-02中aprN序列與NAKMURA等[22]已報(bào)道的序列(GI：262 756)相似性為100%。利用引物NK-F和NK-R從陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組DNA擴(kuò)增得到的目的基因片段與設(shè)計(jì)的突變盒大小(1 540 bp)一致，比原始菌株aprN基因片段大67 bp，如圖5所示。

M-DNA Marker；1-突變盒片段；2-納豆激酶基因片段圖5 突變盒與納豆激酶基因的克隆Fig.5 Cloning of inactivated gene and nattokinase gene

進(jìn)一步對(duì)重組菌中的突變盒進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果與設(shè)計(jì)的基因序列一致，表明突變盒已成功插入到納豆芽孢桿菌TN-02的基因組中并與待突變基因aprN發(fā)生了同源交換。

2.5 納豆激酶基因缺失對(duì)重組菌生長(zhǎng)的影響

在搖瓶培養(yǎng)至第6 h，納豆芽孢桿菌TN-02和重組菌TN-021均開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。可能受到aprN敲除的影響，重組菌TN-021在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)趨勢(shì)慢于原始菌，比原始菌延遲2 h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期。到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)，重組菌和原始菌的最大OD值均在4.1左右，如圖6所示，說(shuō)明敲除aprN對(duì)納豆芽孢桿菌TN-02生長(zhǎng)繁殖無(wú)顯著(P=0.764>0.05)影響。

圖6 重組菌與原始菌生長(zhǎng)曲線Fig.6 Comparison of the cell culture between the recombinant strain TN-021 and the Bacillus natto TN-02

2.6 重組菌纖溶酶活的測(cè)定

在相同搖瓶培養(yǎng)條件下，重組菌TN-021發(fā)酵產(chǎn)物在纖維蛋白平板上未檢測(cè)到纖溶酶活力，與之相比，原始菌纖溶酶活力為7 748.7 U/mL，如圖7-a所示。發(fā)酵上清經(jīng)蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析(圖7-b)后，重組菌TN-021發(fā)酵產(chǎn)物在28 kDa處未檢測(cè)到納豆激酶條帶，表明aprN的缺失阻斷了納豆激酶的合成，證明了納豆激酶是納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵產(chǎn)物中唯一纖溶酶。

a-重組菌與原始菌纖溶酶活測(cè)定;b- SDS-PAGE分析圖7 重組菌與原始菌發(fā)酵產(chǎn)物中纖溶酶檢測(cè)Fig.7 Detection of plasmin in fermentation products of the recombinant strain TN-021 and Bacillus natto TN-02注：a圖：1-100 IU/mL尿激酶標(biāo)樣； 2-原始菌(稀釋80倍)； 3-重組菌。b圖：M-Maker； 1-原始菌； 2-重組菌；3-純化后的納豆激酶。

3 結(jié)論

基于搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在10 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了納豆芽孢桿菌TN-02產(chǎn)納豆激酶放大工藝的研究。采用溫度階段性控制的方式，0～12 h控制溫度為30 ℃，降低菌體生長(zhǎng)速率，12 h后采用35 ℃進(jìn)行發(fā)酵，提高產(chǎn)酶水平，解決了發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和泡沫產(chǎn)生的矛盾，提高了納豆激酶的發(fā)酵活力。通過(guò)流加甘油和胰蛋白胨的補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝，獲得納豆激酶的最高表達(dá)量為13 978.3 U/mL，是搖瓶發(fā)酵最高表達(dá)量的1.8倍。同時(shí)，通過(guò)構(gòu)建納豆激酶基因缺失重組菌TN-021，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后其發(fā)酵產(chǎn)物中未檢測(cè)到纖溶酶活力。證明了納豆激酶是納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵產(chǎn)物中唯一纖溶蛋白酶，為準(zhǔn)確測(cè)定納豆激酶活力提供了有力依據(jù)。