申 琳，徐志堯，王遠敏，運乃茹

(天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300250)

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為常見的活血化瘀藥，其味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效。臨床上主要用于胸痹心痛、脘腹肋痛、癥瘕積聚、熱痹疼痛、心煩不眠、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉、瘡瘍腫痛等癥[1]。丹參中含有丹參酮類、丹參酚酸類、揮發(fā)油、有機元素等成分[2]，其中丹參酮類及酚酸類成分已被證實是丹參中的主要活性成分和特征成分，具有明顯的心血管保護、抗炎、抗氧化、抗纖維化等作用[3]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)丹參具有抗腫瘤的作用[4-6]，亦與丹參酮及丹參酚酸類成分有關[7-9]，但目前對于丹參抗腫瘤作用主要集中在單體及其提取物的研究階段[10，11]，對其作用機制的研究仍不夠全面，缺乏從細胞及分子水平進行系統(tǒng)全面的闡述。

網(wǎng)絡藥理學通過檢索網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫、構建“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡關系并進行網(wǎng)絡拓撲學分析，是一種從整體層次來預測藥物治療疾病作用機制的新方法，其融合了生物信息學、多向藥理學等多學科的技術和內(nèi)容，從多靶點的研究策略出發(fā)，實現(xiàn)藥物作用的綜合網(wǎng)絡分析。因其具有整體性和系統(tǒng)性的特點，網(wǎng)絡藥理學已被廣泛應用于中藥潛在活性成分和作用靶點的預測及作用機制的研究[12]。本研究受徐志堯全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室委托，借助網(wǎng)絡藥理學的方法挖掘丹參主要活性成分及作用靶點與其信號通路及疾病間的關聯(lián)性，從系統(tǒng)生物學整體角度解釋丹參抗腫瘤的作用機制，為進一步深入研究丹參提供了重要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1查找腫瘤病相關靶蛋白 DisGeNET 集成了來自專家管理的資料庫、GWAS目錄、動物模型和科學文獻的數(shù)據(jù)，是比較全面的并可公開獲得人類疾病相關基因的數(shù)據(jù)庫，其數(shù)據(jù)庫包含了17 074個基因，20 370種疾病，561 119個基因-疾病相關[13]，以“cancer”作為關鍵詞(CUL為C0032927，MeSH代碼為D011230)，得到腫瘤-靶點之間的蛋白關系。

1.2基于ADME篩選丹參的活性成分 ADME是藥物動力學，指肌體對外源化學物的吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)及排泄(excretion)過程。ADME的4個關鍵參數(shù)為血腦屏障(blood brain barrier, BBB)、口服生物利用度(oralbioavailability, OB)、滲透性(Caco-2 permeability, Caco-2)和類藥性(druglikeness, DL)，根據(jù)ADME (OB≥30%，DL≥0.18，Caco-2≥-0.4，BBB≥-0.3)篩選丹參活性化合物，整理出每個成分的SMILE結(jié)構，用于后續(xù)成分對應靶點的查找。

1.3篩選丹參治療腫瘤的靶點 HIT是一個豐富的蛋白靶點資源，當前收載了1 301個蛋白靶點(其中221種蛋白為直接靶點)，這些資源源于3 250篇文獻，覆蓋了1 300多種著名中藥的586種活性成分[14]，該數(shù)據(jù)庫可以得到小分子化合物已驗證的靶點；ChemMapper數(shù)據(jù)庫從各類化合物數(shù)據(jù)庫中整合了超過800 000個化合物，其中400 000個化合物包含了生物活性及靶標注釋，該研究通過上傳小分子成分的SMILE結(jié)構，采用配體結(jié)構預測化學成分的靶點[15]，將兩個數(shù)據(jù)庫得到的靶點整合，即為成分對應的靶點。

1.4篩選化合物-疾病共有靶點 根據(jù)丹參化學成分-靶點預測結(jié)果和腫瘤-靶點結(jié)果，以Uniprot 號為標準，篩選出疾病-成分-靶點的相交部分靶點，得到共有靶點，考慮蛋白和蛋白之間存在相互作用，在STRING數(shù)據(jù)庫中檢索出與共有靶點相關的靶點，以評分大于0.90為標準，得到與蛋白直接關聯(lián)的靶點，將關聯(lián)靶點進行去重復，整合，作為最終成分-疾病-靶點，用于成分-靶點后續(xù)的網(wǎng)絡構建。

1.5網(wǎng)絡構建及通路分析 Cytoscape 3.2.1是一種可視化軟件，能更直觀地分析藥物治療疾病的作用機制[16]。其中的節(jié)點(node)是化合物、靶點或疾病，邊(edge)代表這些分子之間的互作關系，即某個成分與靶點或靶點與疾病存在聯(lián)系?；诎悬c預測結(jié)果，采用Cytoscape 3.2.1 軟件構建丹參成分靶點網(wǎng)絡，計算靶點Degree值，以平均值和最大值為篩選條件，提取得到篩選后的網(wǎng)絡，并將關鍵靶點信息上傳到Cytoscape 3.2.1插件進行MCODE 聚類分析、Cluego生物學過程富集分析及Reactome通路富集分析，選取具有統(tǒng)計學意義的所有通路(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1腫瘤疾病相關靶點 腫瘤疾病相關靶點在藥物發(fā)揮中處于重要的位置，藥物只有和靶點結(jié)合后才能發(fā)揮相應的療效。在本研究中，通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫共收集到疾病的靶點438個，與成分共有的靶點34個；STRING數(shù)據(jù)庫擴展后有239條，以大于等于平均自由度作為篩選條件，最終得到59個目標靶點。

2.2活性分子的篩選 通過檢索從丹參中共收集到202個主要化學成分，對收集到的化學成分進行ADME計算(其結(jié)果見表1)，作為潛在的活性成分用于后續(xù)研究，其中部分化合物已被證明在抗腫瘤疾病中具有較好的藥理學活性，如丹參酮ⅡA在乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌等多部位的癌癥中均表現(xiàn)出較好的活性[17]。

2.3成分-靶點網(wǎng)絡構建及分析 對丹參的活性成分和腫瘤作用靶點進行關聯(lián)，得到34個靶點，同時考慮靶點之間存在相互作用，并對關聯(lián)后的靶點進行STRING分析后，得到無重復靶點239個，采用Cytoscape 3.2.1 構建成分-靶點網(wǎng)絡，通過Network analyzer 插件對網(wǎng)絡特征進行分析，得到網(wǎng)絡的Degree值，計算平均自由度為7.18，以大于等于平均自由度為界，篩選出與生物信息較佳的網(wǎng)絡信息圖，即為成分-靶點的關系圖(見圖1)，其整體特征分析結(jié)果如下：網(wǎng)絡節(jié)點數(shù)目為101個，邊為702條，網(wǎng)絡中心度(network centralization)為0.223，網(wǎng)絡密度(network density)為0.112，最短路徑數(shù)(shortestpath)為9 900，平均最短路徑(characteristic pathlength)為2.757。從表1中可以看出丹參酮ⅡA、異丹參酮Ⅱ、隱丹參酮等成分有較多的靶標，而這些成分均具有一定的抗腫瘤作用。因此，這些度值較高的藥物分子可能在丹參抗腫瘤的藥理功能中發(fā)揮相對重要的作用。節(jié)點的網(wǎng)絡度(degree)和介數(shù)(betweeness)常用于描述網(wǎng)絡節(jié)點的重要性，分子-蛋白靶點網(wǎng)絡中蛋白節(jié)點網(wǎng)絡特征(見表2)，分析發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)絡度排列前列的是細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、原癌基因(MYC)、山梨醇脫氫酶(SORD)、人乳糖酶根皮苷水解酶(LCT)、變旋酶(GALM)、二氫二醇脫氫酶(DHDH)、氨基丁酸醛脫氫酶(ALDH9A1)等靶點，其中CDK2[18]是細胞周期調(diào)節(jié)的關鍵激酶，參與細胞增殖、轉(zhuǎn)錄、存活等生理過程，CDK2在多種腫瘤中異?；罨强鼓[瘤藥物研發(fā)的重要靶點之一；MYC原癌基因蛋白為核DNA結(jié)合蛋白，與細胞增殖有關，在多種腫瘤中都有表達增加的報道。介數(shù)排列前三的是蛋白激酶 B (AKT1)、表皮生長因子受體(EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)，其中AKT1是PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路的關鍵因子，其活化受控于嚴密精確的分子機制，多種疾病如癌癥和糖尿病常伴有AKT調(diào)控的紊亂[19]，EGFR是細胞膜表面的糖蛋白受體，屬于Erb B受體家族，是一種受體酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase, RTK)，相對分子量約為170 kD。EGFR具有酪氨酸激酶活性，當與配體-EGF結(jié)合，可使酪氨酸殘基磷酸化，激活EGFR，促進腫瘤細胞的生長、增殖。在腫瘤基礎研究中，已證實EGFR相關抗體及抑制劑可用于腫瘤治療[20]，MAPK1通路的激活會導致細胞的增殖分化[21]。接近中心性(closeness centrality)反應網(wǎng)絡中某一節(jié)點與其他節(jié)點接近程度，其數(shù)值越大，生物活性就越高，平均最短路徑長度(Average shortest path length)值越小，說明節(jié)點在網(wǎng)絡中越位重要，接近中心性和平均最短路徑長度排列前列的是CDK2、MAPK1、CDK1、CCNB1d等，說明這些靶點在丹參抗腫瘤的過程中較為重要。

表1 丹參活性成分信息

表2 分子-蛋白網(wǎng)絡特征列表

續(xù)表2

圖1 分子-靶點網(wǎng)絡圖

(注：菱形表示化合物，圓形表示靶點；degree值越大，靶點形狀越大，靶點顏色由綠色向紅色漸變)

2.4MCODE聚類分析 MCODE 是基于密度的非交疊式聚類算法[22]，該方法以節(jié)點為中心進行擴展，在其鄰居節(jié)點中尋找滿足要求的節(jié)點，從而形成一個功能模塊，可將不同類別生物過程分為不同的“子簇”，同一“子簇”下的生物過程具有相似的功能特性，本文根據(jù)節(jié)點的默認參數(shù)和其中描述的分數(shù)進行過濾，將關聯(lián)性較高的節(jié)點從復雜的網(wǎng)絡圖中提取出來，并根據(jù)密度和大小的得分進行排序，最終得到4個各具相似功能的子簇，涉及到37個靶點，具體結(jié)果見表3。其中聚類1組合涉及到的靶點有AURKA、CDC25B、YWHAE等，該研究表明丹參酮Ⅵ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA等成分可能具有相似的生物作用。

表3 MCODE 聚類分析結(jié)果表

2.5Go生物學功能分析 將59個潛在靶點導入Cytoscape 軟件中進行Cluego分析[23]，Go功能富集發(fā)現(xiàn)丹參抗腫瘤的生物過程共有21條(見圖2)，主要包括肌細胞增殖、乳腺上皮發(fā)育、生長激素、胎盤發(fā)育等，這些生物過程與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。其中肌細胞增殖涉及到AKR1B1、AKT1、AURKA等39個靶點，乳腺上皮發(fā)育涉及到AKR1B1、AKT1、CCND1等22個靶點，生長激素涉及到AKR1B1、AKT1、CDKN1A等21個靶點，胎盤發(fā)育涉及到AKR1B1、AKT1、CCND1等24個靶點(見表4)，表明丹參可能通過調(diào)控酶活性、炎癥因子、表皮生長因子等抑制肌細胞增殖、乳腺上皮發(fā)育、生長激素等生物過程。該結(jié)果反映了腫瘤發(fā)病涉及體內(nèi)多個生物過程的異常，同時也表明丹參可能是通過調(diào)節(jié)這些生物過程發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖2 Cluego分析結(jié)果

表4 Cluego分析基因功能組

2.6Reactome通路分析 生物通路是理解疾病發(fā)生、發(fā)展的生理基礎，藥物通過功能蛋白的作用調(diào)控相關的生物通路，從而執(zhí)行特定的生物功能[24]。Reactome分析結(jié)果表明小分子作用于疾病的通路與白介素-4和13信號(CDKN1A、CCND1、MYC等靶點)、基因轉(zhuǎn)錄(YWHAE、CDKN1A、YWHAB等)、Chk1/Chk2(Cds1)介導的Cyclin B和CDK1復合物失活(YWHAE、YWHAB、YWHAQ等)、免疫系統(tǒng)中的細胞因子信號(CDKN1A、YWHAB、IFIT1)等通路有關，說明小分子化合物抗腫瘤作用涉及到炎癥、基因轉(zhuǎn)錄、影響腫瘤增殖的途徑等，具體結(jié)果見表5。

表5 Reactome分析部分結(jié)果表

3 討論

目前腫瘤已經(jīng)成為危害人類健康最嚴重的疾病之一，預計到2020年全球腫瘤導致死亡的病例將高達2 000多萬，我國腫瘤發(fā)病率也呈逐年上升趨勢[25]。中藥作為我國的傳統(tǒng)藥物，在腫瘤的防治過程中發(fā)揮了重要作用，在增強肌體免疫功能、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥、抑制腫瘤細胞分裂增殖、加快腫瘤細胞凋亡等方面的作用和機理逐漸被揭示，為中藥在抗腫瘤中的有效應用奠定了基礎[26]。有研究表明，丹參具有抗腫瘤的作用與丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮等成分有關，但其他的可能具有抗腫瘤的成分尚未被研究，其中可能蘊藏著有成藥潛力的先導化合物，同時對隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮的作用機制還不夠全面[7]。因此，對丹參抗腫瘤潛在化合物的挖掘及靶點和分子機制的研究顯得極為重要。網(wǎng)絡藥理學可以從細胞及分子水平出發(fā)，為系統(tǒng)研究中藥的藥效物質(zhì)基礎和作用機制提供新的思路。

本文通過成分篩選、靶點預測、網(wǎng)絡構建以及通路分析的網(wǎng)絡藥理學方法對丹參抗腫瘤的作用機制進行研究，篩選出丹參的活性成分，對其治療腫瘤的潛在分子作用機制進行闡述，具有重要的研究意義。研究發(fā)現(xiàn)，丹參中包括丹參素、丹參酮ⅡA、異丹參酮等在內(nèi)的42個主要活性化合物，通過CDK2、SORD、MYC、LCT等關鍵靶點起到抗腫瘤效果，聚類分析可將生物作用相似度較高的成分、靶點聚為4類，共涉及到37個靶點，進一步的通路分析發(fā)現(xiàn)丹參中活性小分子抗腫瘤的作用與肌細胞增殖、乳腺上皮發(fā)育、生長激素、胎盤發(fā)育等生物過程有關，Reactome結(jié)果表明小分子化合物能影響白介素-4、13及腫瘤類屬的信號轉(zhuǎn)錄?？傊?，丹參抗腫瘤作用是多成分、多靶點共同作用的結(jié)果，這些結(jié)果揭示了丹參抗腫瘤可能的化學成分及相關成分的作用靶點和信號通路，該研究可為丹參抗腫瘤成分及作用機制的深入研究提供有價值的參考依據(jù)。